Metylenblått som anaerob- och syreindikator: vad färgförändringen bevisar

En laboratorietekniker försluter en anaerobburk, kontrollerar indikatorremsan med metylenblått genom locket och ser det hon vill se. Remsan har gått från blå till vit. Hon dokumenterar körningen som anaerob och går vidare. Två dagar senare växer ingenting på en platta, medan ett förslutet buljongrör i samma burk visar tecken på syreexponering. Remsan talade sanning. Hon ställde fel fråga till den.

Förvirringen beror på en sammanblandning av begrepp. En anaerobindikator med metylenblått handlar om redox, inte om sterilitet och inte om validering av hela systemet. När den skillnaden är tydlig blir remsan ett precist och tillförlitligt instrument med en avgränsad uppgift.

Principen: ett reversibelt redoxpar

Löst metylenblått förekommer i två tillstånd. Den oxiderade formen är den välbekanta blå katjonen. Den reducerade formen, som kallas leukometylenblått, är färglös. Nära neutralt pH innebär den förenklade halvreaktionen att en blå katjon plus en proton plus två elektroner ger en färglös leukomolekyl. Formalpotentialen ligger nära plus 11 millivolt relativt standardväteelektroden vid pH 7, vilket placerar den i ett intervall som många reducerande system kan nå och där syre kan vända reaktionen.

Reduktion kräver en låg lokal redoxpotential. Att bara avlägsna syre räcker inte alltid. Tidiga studier av anaeroba förhållanden visade att metylenblått i rent, syrefritt vatten behöll sin färg om inget reducerande ämne fanns närvarande, och att blandningar av glukosbuljong med cirka 0.01 procent färgämne lätt avfärgades vid 37 C, medan samma blandning vid 4 C förblev blå i ett dygn, enligt försök med färsk vävnad och anaeroba odlingsförhållanden. Temperatur, pH, glukos, askorbat, tioglykolat och mikrobiell reducerande aktivitet avgör alla om elektronerna är tillgängliga.

Återoxidation kräver bara syre. När luft når leukoformen omvandlas den tillbaka till blått. Moderna specialutvecklade indikatorer utnyttjar just denna cykel: färgämne plus reduktionsmedel plus en stabiliserande matris, färglös vid låg syrehalt och åter blå vid exponering för luft, vilket demonstrerats i en hybridbaserad syreindikator med metylenblått, reduktionsmedel, ytaktivt ämne och lera. Den prototypen använde 0.01 millimolärt färgämne med 2.0 millimolärt askorbat eller glukos vid pH 11, blev färglös nära 0.5 volymprocent syre och kunde skilja mellan under 0.1 procent och över 0.5 procent syre i sin testkammare.

Funktionsprincipen är alltså enkel. Blått betyder att indikatorzonen är oxiderad. Färglöst betyder att indikatorzonen har uppnått reducerande förhållanden med låg syrehalt. Förändringen är reversibel, lokal och kemisk. I sig säger den ingenting om mikrober.

Så fungerar en indikatorremsa med metylenblått i en anaerobburk

En indikatorremsa med metylenblått för en anaerobburk är en liten reaktionszon som placeras i burkens atmosfär där den kan ses utan att kärlet öppnas. Kommersiella utföranden varierar: pappersremsor, tabletter som löses upp eller fuktas vid iordningställandet och nyare hybridpapper. Vissa kräver en droppe destillerat vatten för att aktivera reaktionszonen. Andra är torra indikatorer som måste förbli torra. Bruksanvisningen för den specifika produkten gäller, eftersom fuktning, placering och avläsningstid är en del av kemin.

Den avsedda avläsningen är i praktiken binär. Blått betyder att syre eller otillräckligt reducerande förhållanden kvarstår vid remsan. Vitt eller färglöst betyder att anaeroba redoxförhållanden har etablerats vid remsan. Vissa kommersiella pappersindikatorer har ett tillsatt rött bakgrundspigment, så deras reducerade slutläge är rosa snarare än vitt. Ta reda på vilket slutläge din produkt ska visa innan du bedömer den.

Tidsförloppet varierar mellan olika system. I en uppställning av GasPak-typ började färgen blekna inom ungefär en timme och försvann helt inom några timmar, medan metylenblått behövde mer än sex timmar i en kontrollerad jämförelse vid rumstemperatur. I den studien nådde odlingsmediets redoxpotential ungefär minus 100 millivolt inom 60 till 100 minuter, långt innan färgämnet hade ändrat färg färdigt, och låg långt under minus 200 millivolt när remsan blev helt färglös. Indikatorn släpar efter atmosfären. En blå remsa efter en timme bevisar inte att systemet har misslyckats, och en vit remsa efter sex timmar beskriver remsan vid just den tidpunkten.

Placeringen spelar roll av samma anledning. Håll remsan i gasutrymmet, synlig genom locket, på avstånd från agarytor och odlingsmedier. Den visar förhållandena i sin omedelbara omgivning. Lägg den platt mot en kall vägg, begrav den under plattor eller låt kondensvatten genomdränka den, så visar den den mikromiljön i stället för burkens miljö.

Vad remsan visar och vad den inte visar

Betrakta metylenblåttindikatorn i anaerobburken som en sensor på en plats. Den visar lokala redox- och syreförhållanden i sin egen reaktionszon, som i stora drag är representativa för gasutrymmet om blandning och utjämning är tillräckliga. Allt därutöver är slutsatser som kräver separata belägg.

En färglös remsa fastställer inte sterilitet. Sterilitet innebär frånvaro av livsdugliga organismer och styrks genom validerad sterilisering och valideringskontroller med odling. En burk kan vara helt anaerob och ändå kontaminerad, eller helt steril och ändå aerob.

Den validerar inte varje del av odlingssystemet. Löst syre i ett förslutet rör, syre som är instängt djupt i agar, gradienter i en fullpackad burk och ett läckage som uppstår efter avläsningen undgår alla en enda remsa. Rumsliga experiment har visat intilliggande blå och färglösa zoner i samma kärl där balansen mellan syreinträngning och reducerande aktivitet skilde sig åt. En enda punkt kan inte verifiera en hel volym.

Den bevisar inte att anaeroba förhållanden har rått oavbrutet. En remsa som läses av en gång vid starten säger ingenting om förhållandena efter tjugo timmar. Nyare kvalitetsarbete kring anaeroba förhållanden varnar för att kemiska indikatorer beskriver atmosfären vid avläsningstillfället och kan se tillfredsställande ut trots att små mängder syre finns kvar. Det är kontinuerlig dokumentation eller dokumentation vid kontrollpunkter, inte en enda blick på slutläget, som kopplar remsan till inkubationen.

För den bakomliggande kemin i färgförändringen, se hur metylenblått växlar mellan oxiderat och reducerat tillstånd. För hur syre mer generellt påverkar provhantering, se syrekontroll vid mikroskopi och odlingsarbete.

Ett diagram att ha bredvid burken

Figuren nedan sammanfattar artikeln i en referens för laboratoriebänken. Tre tillstånd hos samma remsa, reaktionens två riktningar och gränsen mellan indikatorns belägg och validering av systemet.

Fel som håller remsan blå eller ger falsk trygghet

De flesta fel tillhör fem grupper. Varje grupp har sina egna kännetecken.

En läckande burk eller påse fortsätter att tillföra syre till reaktionszonen. Remsan förblir blå eller blir blå igen efter att ha bleknat. Kontrollera locket, packningen, klämmorna och tätningsytorna innan du skyller på kemin.

En förbrukad eller felaktigt aktiverad gasgenerator avlägsnar aldrig syret. I äldre vattenaktiverade system var utebliven kondens efter ungefär 10 till 15 minuter och utebliven uppvärmning av locket efter ungefär 20 till 40 minuter tidiga varningssignaler för just det systemet. En underdimensionerad påse i en överlastad burk ger samma fel.

En förgiftad katalysator är bara relevant för äldre system med vätgas och palladium, där palladium får vätgas och syre att reagera till vatten. Fukt och svavelväte försämrar katalysatorn. Många av dagens påsar använder inget palladium alls, så tillämpa inte denna åtgärd där den inte hör hemma.

En nedbruten eller felhanterad remsa kan sluta fungera utan tydliga tecken. Färgämnet och reduktionsmedlet förlorar sin reversibilitet under lagring, vilket är en anledning till att hybridformuleringar utvecklades för att motstå ljusblekning och försämring vid lagring. Kassera produkter som passerat utgångsdatum, produkter med onormal startfärg och remsor som fuktats när de ska vara torra eller lämnats torra när de behöver fuktas.

En gradient eller fördröjning vilseleder den som läser av, snarare än att vara ett fel i kemin. Dåligt blandat gasutrymme, förslutna rör med löst syre och halvfasta medier behåller var och en sina egna förhållanden längre än remsan antyder. Resazurinremsor går via rosa till färglöst och marknadsförs ofta som snabbare, men deras tröskelvärden hör till deras egen formulering och kan inte överföras till metylenblått.

Kontroller och ett avläsningsprotokoll att ta efter

Två billiga kontroller fångar upp de flesta feltolkningar. Ha en ny kontrollremsa i rumsluft vid sidan av körningen. En fungerande remsa med metylenblått förblir blå där. Vissa förpackade indikatorer är bleka från början och blir blå när förpackningen öppnas, vilket i sig är en funktionskontroll. Placera dessutom med jämna mellanrum en ny remsa i en tidigare validerad anaerob uppställning. Den ska nå det validerade reducerade slutläget inom den tid som anges för produkten. Om någon av kontrollerna avviker ska du byta ut partiet innan du förlitar dig på avläsningar från burken.

Avläsningsprotokollet följer av mekanismen. Placera remsan så att den är synlig i gasutrymmet utan att burken behöver öppnas, och följ produktbladets anvisningar om väggkontakt och fuktning. Dokumentera startfärgen, tidpunkten då burken förslöts och färgen vid den kontrollpunkt som anges för produkten. Där kärlets utformning tillåter det, dokumentera att indikatorn förblev reducerad vid bestämda kontrollpunkter under inkubationen. Dokumentera slutfärgen omedelbart före öppning. Den färgen är slutvärdet för körningen. Efter öppning ska du förvänta dig att remsan blir blå igen och inte låta det ändra bedömningen i efterhand.

Om remsan förblir blå efter den angivna tiden ska anaeroba förhållanden betraktas som overifierade. Gå igenom kedjan i ordning: tätning, påse, katalysator om sådan finns, indikatorns fuktning och utgångsdatum och därefter indikatorns funktion jämfört med luftkontrollen. Först när atmosfären är verifierad ska tillväxt eller utebliven tillväxt tolkas, med en anaerob odlingsuppställning och organismkontroller som är anpassade till tillämpningen.

Remsan förtjänar sista ordet inom sitt eget område. Blå eller färglös besvarar den en fråga om en plats vid en tidpunkt. Ställ den frågan enligt tidsplanen, med kontroller bredvid, så svarar den tillförlitligt. Fråga den om sterilitet, om varje rör eller om hela inkubationen utifrån en enda blick, så kan ingen indikatorkemi rädda tolkningen.