Metylenblått och kvävemonoxid: NOS, cGMP och vaskulär signalering

Frågan låter enkel: hämmar metylenblått kvävemonoxid? I laboratoriet delas svaret upp i fyra separata frågor, och var och en kräver ett eget experimentellt test. Att blanda ihop dem är den främsta anledningen till att texter om metylenblått och kvävemonoxid låter säkra men förblir vaga.

Tänk på kvävemonoxidsignalen som en kedja med fyra länkar. En gen transkriberas för att bilda kvävemonoxidsyntas. Enzymet omvandlar arginin till kvävemonoxid. Gasen diffunderar till sitt mål innan den reagerar med något annat. Lösligt guanylatcyklas känner av den och bildar cykliskt GMP. Publicerade studier visar effekter av metylenblått vid varje länk, men beläggen kommer från olika försöksmodeller, olika koncentrationer och olika isoformer. Ett resultat vid en länk bevisar inte en verkan vid en annan.

Den vedertagna kedjan, enkelt beskriven

I en blodkärlsvägg ser den normala sekvensen ut så här. Ett stimulus verkar på en endotelcell. Endotelialt kvävemonoxidsyntas, som kallas eNOS eller NOS3, bildar en liten puls av kvävemonoxid. Gasen diffunderar in i den intilliggande glatta muskelcellen, binder till hemgruppen med reducerat järn i lösligt guanylatcyklas och påskyndar omvandlingen av GTP till cykliskt GMP. Cykliskt GMP aktiverar proteinkinas G, kalciumhanteringen förändras och muskeln slappnar av.

Det finns en andra kedja som är värd att hålla isär från den första. Vid infektion eller exponering för cytokiner transkriberar cellerna genen för ett annat enzym, inducerbart kvävemonoxidsyntas eller iNOS, även kallat NOS2. Det ger större och mer långvariga kvävemonoxidflöden än eNOS. En tredje isoform, neuronalt NOS eller nNOS, hör till ytterligare ett sammanhang. När en artikel nämner kvävemonoxidsyntas utan att ange isoformen, stanna upp och kontrollera vilken som mättes. Översikten över hur metylenblått överför elektroner gör samma poäng om redoxmål i allmänhet: elektronförmedlingen gör ingenting på egen hand, och partnern i vardera änden avgör utfallet.

Uppmätt cykliskt GMP är också ett sammanvägt mått, inte en direkt enzymanalys. Nivån återspeglar syntes genom cyklas minus nedbrytning genom fosfodiesteraser, särskilt PDE5 i kärlens glatta muskulatur. En minskning av cykliskt GMP betyder därför att mindre signal nådde detektorn. Den visar inte i sig vilken länk som brast.

Länk 1: mindre iNOS-enzym bildas

I makrofager från möss som stimulerades med bakteriell lipopolysackarid, interferon gamma eller båda förhindrade metylenblått den förväntade ökningen av iNOS-protein och minskade kraftigt mängden iNOS-mRNA i transkriptionsförsöken med makrofager. Det upplysande är vad som inte förändrades. Nedbrytningen av hämmaren I kappa B alfa, fosforyleringen av NF kappa B och STAT1 samt dessa faktorers förflyttning till cellkärnan förblev i stort sett oförändrade. Det som minskade var deras bindning till DNA, vilket bekräftades med kromatinimmunoprecipitering som visade minskad bindning vid iNOS-promotorn.

Det är en genreglerande effekt som föregår förändringen i enzymmängd, inte en akut blockad av ett befintligt enzym. Den hör till inflammatorisk signalering, där transkriptionsfaktorer måste binda till en promotor innan protein bildas. Den säger inget direkt om konstitutivt eNOS i ett kärl i vila och bör beskrivas utifrån dessa begränsningar.

Länk 2: det befintliga NOS-enzymet arbetar långsammare

En råttstudie undersökte en annan nivå. Vakna hanråttor fick lipopolysackarid intravenöst och sedan, tre timmar senare, antingen koksaltlösning eller metylenblått i dosen 3 mg per kg intravenöst. Aktiviteten hos kvävemonoxidsyntas i den mediala basala hypotalamus mättes genom omvandling av märkt arginin till citrullin i studien av NOS-aktivitet i hypotalamus. Enbart stress tillsammans med koksaltlösning inducerade viss kalciumoberoende aktivitet, och lipopolysackarid ökade den till ungefär tio gånger kontrollnivån. Metylenblått eliminerade båda de inducerade komponenterna. Den kalciumberoende konstitutiva aktiviteten förändrades inte i den vävnaden vid den dosen och tidpunkten.

Läs resultatet precis som det står: minskad uppmätt aktivitet av iNOS-typ under dessa förhållanden. Det är inte ett mått på genuttryck, och det är inte ett bevis för genomgående selektivitet för iNOS framför eNOS eller nNOS. Studier med renade enzymer understryker behovet av försiktighet. I direkta analyser av renat kvävemonoxidsyntas blockerade metylenblått citrullinbildningen helt vid 30 mikromolar, med en koncentration för halva hämningen nära 5.3 mikromolar utan superoxiddismutas och 9.2 mikromolar med det, enligt jämförelsen mellan renat NOS och guanylatcyklas. En separat studie med renat nNOS pekade på oxidation av enzymbundet hem. Den praktiska lärdomen är att direkt NOS-hämning förekommer i isolerade system, men resultatet från hypotalamus kan inte tänjas till ett allmänt påstående om att metylenblått lämnar allt konstitutivt NOS opåverkat överallt.

Länk 3: kvävemonoxid går förlorad innan den når fram

Det tydligaste belägget för att något annat än enzymblockad kan förklara en minskning av cykliskt GMP kommer från odlade glatta muskelceller från kaninens lungartär. Försöksupplägget kringgick endogent NOS helt genom att tillsätta kvävemonoxiddonatorer direkt och undersökte sedan om metylenblått fortfarande minskade svaret i cykliskt GMP i studien av superoxid i kärlens glatta muskulatur.

Tre donatorer testades från 1 till 100 mikromolar: S-nitroso-L-cystein, natriumnitroprussid och en stabil deaminerad analog som kallas MPANO. Alla ökade cykliskt GMP till ungefär 1.5 till 12 gånger utgångsnivån. Metylenblått vid 10 mikromolar hämmade svaret från de två första med 51 till 100 procent och lämnade MPANO-svaret oförändrat. Om metylenblått bara blockerade cyklasets katalytiska centrum skulle denna donatorselektivitet vara svår att förklara, eftersom alla tre verkar via samma efterföljande enzym.

Tre kontroller knöt sedan mekanismen till superoxid. För det första gav extracellulär superoxid som bildades med xantin plus xantinoxidas samma mönster: CYSNO och nitroprussid blockerades, medan MPANO förblev opåverkat. För det andra orsakade metylenblått dos- och tidsberoende superoxidproduktion från de glatta muskelcellerna, mätt genom reduktion av cytokrom c. För det tredje förhindrade superoxiddismutas hämningen helt, medan katalas inte gjorde det. Detta pekar på superoxid snarare än väteperoxid som den direkt verkande reaktiva formen i den försöksmodellen.

Samodlingsversionen av försöket är värd att beskriva eftersom den visar var effekten uppstår. Endotelceller på täckglas samodlades kortvarigt med glatta muskelceller, så att basalt frisatt endotelfaktor ökade cykliskt GMP i den glatta muskulaturen till tre till åtta gånger utgångsnivån. Förbehandling av endera cellgruppen med metylenblått minskade signalen, och superoxiddismutas motverkade delvis effekten av förbehandling av endotelcellerna. Metylenblått behöver med andra ord inte alls verka inne i den glatta muskelcell som känner av signalen. Det kan minska signalen genom att avlägsna budbäraren på vägen. Guiden till att läsa forskning om metylenblått behandlar detta som en allmän regel: ange i vilket kompartment ingreppet gjordes innan du anger ett molekylärt mål.

Att kalla detta NOS-hämning vore fel. Inget syntassteg krävdes för att donatorerna skulle fungera, men signalen minskade ändå.

Länk 4: själva detektorn reagerar mindre

Direkta effekter på lösligt guanylatcyklas förekommer, men koncentrationerna spelar roll. I den ovan nämnda jämförelsen med renade enzymer behövde kvävemonoxidstimulerat cyklas ungefär 60 mikromolar metylenblått för halva hämningen, jämfört med nära 5 till 9 mikromolar för NOS. Även 1 millimolar gav bara en partiell maximal blockad. Det motsvarar en ungefär sex- till elvafaldig skillnad. Ett cellförsök vid låg mikromolär koncentration där cykliskt GMP minskar kan därför inte betecknas som selektiv cyklashämning enbart utifrån värdet för cykliskt GMP.

En senare redoxstudie gav ytterligare ett skäl till försiktighet: metylenblått inaktiverade kvävemonoxidaktiverat cyklas genom en mekanism som skilde sig från enkel oxidation av hemjärnet med luftens syre. Detektorns funktion kan alltså försämras, men kemin är inte klarlagd, och koncentrationsskillnaden innebär att effekterna på superoxid och NOS först bör uteslutas vid låga mikromolära exponeringar. Här hör också kontroll av fosfodiesterasaktivitet hemma. Om nedbrytningen inte mättes eller blockerades är minskad ansamling av cykliskt GMP förenlig med mindre syntes, snabbare nedbrytning eller båda.

Varför detta inte kan reduceras till ett enda påstående om blodtryck

Varje länk fastställdes i ett annat system. Transkription i makrofager är inte enzymaktivitet i hypotalamus. Aktivitet i hypotalamus efter lipopolysackarid är inte endotelial kärltonus i vila. Basalt frisatt endotelfaktor i samodling är inte agoniststimulerad kärlvidgning. Odlade lungartärceller vid 10 mikromolar metylenblått är inte ett mänskligt cirkulationssystem. Att slå ihop resultaten till ett påstående som att metylenblått höjer blodtrycket genom att blockera kvävemonoxid innebär att man bortser från just de skillnader som kontrollerna utformades för att bevara.

Tre kontroller gör framställningen rättvisande. Ange först isoformen: eNOS för kärltonus i vila, iNOS för inducerat inflammatoriskt flöde, nNOS för neuronala sammanhang och vissa försök med renade enzymer. Ange sedan hur kvävemonoxidsignalen tillförs: endogen syntes, basal frisättning från endotelet eller en specifik donator som CYSNO, nitroprussid eller MPANO, eftersom den stabila donatorn stod emot metylenblått medan de labila inte gjorde det. Ange slutligen koncentrationen och vad som återställer svaret: återställning med superoxiddismutas pekar på superoxid, utebliven effekt av katalas talar emot väteperoxid i den försöksmodellen, efterlikning med xantinoxidas visar att mekanismen är tillräcklig, och analyser med renade enzymer skiljer direkta effekter på katalysen från förluster under transporten.

Den korta sammanfattningen är denna. Metylenblått bör snarare betraktas som ett ämne som påverkar signaleringen från kvävemonoxid till cykliskt GMP på flera ställen än som en selektiv cyklasblockerare. Beroende på försöksmodell och koncentration kan det minska transkriptionsfaktorernas bindning vid iNOS-genen, direkt hämma NOS-enzymer, minska tillgängligheten av kvävemonoxid genom superoxidbildning och försämra funktionen hos kvävemonoxidaktiverat cyklas. Rollen för cykliskt GMP-signalering i kärlstudier och jämförelsen av kvävemonoxiddonatorer som används i cellanalyser behandlar varsin av dessa grenar mer ingående, och metoderna för att skilja redoxeffekter från enzymeffekter förklarar varför superoxiddismutas tillsammans med katalas och en kontroll med en stabil donator förekommer så ofta i denna litteratur.

Ett lågt värde för cykliskt GMP efter metylenblått visar att kedjan har brutits. Bara kontrollerna visar vilken länk som brast.