Mätning av reaktiva syreföreningar i försök med metylenblått

Två laboratorier genomför vad båda kallar ett antioxidantförsök med metylenblått. Det ena rapporterar att färgämnet hämmar reaktiva syreföreningar. Det andra rapporterar att det bildar dem. Båda visar tydliga dos–responskurvor. Båda är uppriktiga. Skillnaden beror inte på fusk eller inkompetens. Den beror på att de två grupperna mätte olika saker under olika ljusförhållanden, med prober som besvarar olika frågor, och sedan beskrev båda svaren med samma ord: ROS.

Metylenblått är en svår molekyl att mäta just eftersom den deltar i den kemi som den är tänkt att observera. I mörker transporterar den elektroner mellan donatorer och acceptorer och återgår till sin ursprungliga form, redo för en ny cykel. Under ljus blir den en fotosensibilisator och når ett exciterat triplettillstånd, från vilket den kan överföra energi till syre för att bilda singlettsyre eller överföra elektroner för att bilda radikaler och väteperoxid. Varje prob som tillförs detta system kan oxideras, reduceras, blekas eller maskeras optiskt av själva färgämnet. Den första frågan vid en ROS-avläsning är därför aldrig vilket tal man får. Den är vad analysen faktiskt detekterar och vad färgämnet gör med analysen.

Amplex Red: en kalibrerad väteperoxidanalys

Kombinationen metylenblått och Amplex Red är den mest välgrundade i denna litteratur, när den används korrekt. Kemin är specifik: pepparrotsperoxidas använder väteperoxid för att oxidera Amplex-substratet till en fluorescerande produkt, resorufin, med ungefär ett-till-ett-stökiometri. Peroxid från provet blir till fluorescens i detektorn. Ingen annan förening i den klassiska ROS-gruppen driver denna reaktion direkt.

Den avgörande fördelen är kalibreringen. En noggrann analytiker kör kända peroxidstandarder i samma buffert, med samma peroxidas- och substratkoncentrationer, samma inkubationstid och samma optiska inställningar, och avläser sedan proverna mot denna kurva. I studien på isolerade hjärnmitokondrier som ligger till grund för metoden gjorde författarna just detta: de tillsatte kända mängder peroxid i slutet av varje körning, och resultaten rapporteras som hastigheter i pikomol per minut per milligram protein i stället för godtyckliga fluorescensenheter. Det är detta som gör ett ljussken till en mätning.

Tre detaljer från den studien är värda att efterlikna. För det första verifierade författarna signalen med katalas, som bryter ned peroxid. Den metylenblåttinducerade fluorescensökningen upphörde när katalas tillsattes, vilket bekräftade att signalen kom från peroxid och inte från en optisk artefakt. För det andra testade de belysningen direkt genom att använda en slutare på excitationsstrålen så att proverna fick en åttondel av den normala ljusdosen, och signalen minskade med endast nio procent. Mer än nittio procent av den peroxid de rapporterade var oberoende av mätljuset. För det tredje mätte de peroxidelimineringen separat med en elektrod och fann att färgämnet både ökade produktionen och bromsade elimineringen. En prob som bara rapporterar nettofluorescens skulle ha blandat ihop dessa två effekter.

Analysen har fortfarande felkällor, och metylenblått ger upphov till flera av dem. Färgämnet absorberar över ett brett område i samma röda spektralområde där resorufin emitterar, så vid höga färgämneskoncentrationer kan provet maskera sin egen signal genom inre filtereffekter. Standarderna bör därför innehålla samma färgämneskoncentration som proverna. Amplex Red kan också fotooxideras på egen hand, och dess produkt resorufin kan delta i fotoredoxcykler som bildar superoxid och peroxid, vilket är särskilt viktigt när försöket även belyser en fotosensibilisator. Den praktiska lösningen är att först bestråla metylenblåttproverna och sedan analysera delprover med Amplex-reagens i mörker, i stället för att belysa färgämne och prob tillsammans. Slutligen hämmar superoxiddismutas inte bara en Amplex-signal: omvandling av superoxid till peroxid kan höja den. En SOD-kontroll som ökar fluorescensen har inte misslyckats. Den har identifierat superoxid som en förening uppströms i reaktionskedjan.

DCFDA: en ospecifik oxidationsindikator

Kombinationen metylenblått och DCFDA är källan till det mesta av förvirringen. DCFH-DA är en prekursor som tas upp i celler. Esteraser inne i cellen avlägsnar dess acetatgrupper så att icke-fluorescerande DCFH återstår, och oxidation av DCFH ger fluorescerande DCF. Listan över ämnen som oxiderar det är lång: hydroxylradikaler, peroxidas- och hemintermediärer, kvävedioxid, hypoklorsyra och radikaler som härrör från peroxynitrit. Enbart väteperoxid oxiderar det inte direkt med någon praktiskt användbar hastighet; peroxidberoende fluorescens kräver i regel järn, hemproteiner eller peroxidaskemi i reaktionskedjan.

Den kritik som varje metodavsnitt bör hänvisa till kommer från Kalyanaraman och kollegors analys av DCFH som prob, sammanfattad i studien på hjärnmitokondrier som av detta skäl avvisade DCFDA. De visade att färgämnet reagerar långsamt, med okarakteriserad stökiometri, utan giltig kalibrering och med föreningar som inte är ROS. Proben förstärker också det den mäter: enelektronoxidation av DCFH bildar en DCF-radikal som reagerar med syre och bildar superoxid, som dismuterar till ytterligare peroxid. Avläsningen skapar delvis själv den kemi som den rapporterar.

Inget av detta gör DCFDA oanvändbart. Det gör metoden till en screening, inte en identifiering. En ökning av DCF-fluorescensen betyder att den oxidantberoende oxidationen av proben har ökat. Det betyder inte att peroxid har ökat, och det betyder definitivt inte att den totala mängden ROS har ökat, en storhet som ingen enskild prob mäter. Tidigare studier av metylenblått som förlitade sig på DCF-oxidation vid koncentrationer över en mikromolar rapporterade prooxidativa effekter, medan andra system under samma period visade skydd mot peroxidinducerad celldöd. Båda observationerna kan vara sanna för samma färgämne i olika redoxmiljöer, och DCF-resultatet ensamt kan inte avgöra vilken oxidant som gav upphov till signalen. Det viktiga med det tidigare arbetet på hjärnmitokondrier är att denna screening ersattes med en kalibrerad peroxidmätning, som visade belastningen direkt: redan hundra nanomolar färgämne ökade peroxidfrisättningen flera gånger för samtliga testade substrat och respirationstillstånd.

DCFDA har ytterligare en metylenblåttspecifik fallgrop. Färgämnet är intensivt färgat och redoxaktivt, så det kan bleka fluorescensen, släcka emissionen eller oxidera proben oberoende av cellulära ROS. En cellfri kontroll med färgämne och prob men utan celler är inte ett valfritt tillägg. Det är försöket som visar om färgämnet interagerar med proben.

Spin trapping och syreupptag: identitet och flöde

Medan fluorescerande prober visar att något oxiderande har uppstått, ger elektronspinnresonans med spinnfällor en tydligare bild av vad det var. Den klassiska studien av metylenblåtts fotokemi använde ESR för att detektera askorbatradikalen från färgämne, askorbat och ljus, och visade därefter peroxidbildning i syreupptagsförsök och järnkatalyserad bildning av hydroxylradikaler i försök med spin trapping. Varje teknik besvarade en fråga som de andra inte kunde besvara: ESR gav radikalens identitet, syreupptaget gav reaktionsflödet oberoende av fluorescerande prober, och kombinationen visade att både singlettsyrevägar och radikalvägar var aktiva i samma belysta system.

Resultatet från 1984 fungerar fortfarande som en varning. Vid belysning och i närvaro av ett reduktionsmedel bildade färgämnet peroxid, och när järn fanns närvarande bildade systemet hydroxylradikalen, den mest reaktiva föreningen i gruppen. Författarna kopplade detta till askorbat i ögat och ifrågasatte rutinmässig oftalmisk användning. Dagens läsare bör notera betingelserna: ljus plus reduktionsmedel plus järn. Ta bort någon av dessa så försvagas eller försvinner reaktionsvägen.

Syreelektroder motiverar sin plats på ett annat sätt. En elektrod av Clark-typ mäter nettosyreförbrukningen, vilket visar att färgämnesdriven redoxkemi förbrukar molekylärt syre och ger kinetik som ingen fluorescensartefakt kan efterlikna. Den identifierar inte produkten. Peroxid, superoxid, vatten och avklingning av singlettsyre förbrukar alla syre. Flöde utan identitet är lika ofullständigt som identitet utan flöde, vilket är skälet till att de starka studierna kombinerar elektroden med en kalibrerad peroxidanalys eller en spinnfälla.

Varför antioxidantresultat motsäger varandra

Om de tre avläsningarna ställs sida vid sida kan de skenbara motsägelserna i litteraturen om metylenblått förklaras av metodskillnader och tre biologiska fakta.

För det första är färgämnet både en elektrontransportör och en peroxidkälla. Genom att leda bort elektroner från de ställen i andningskedjan där syre annars skulle bli superoxid kan det minska en ROS, samtidigt som dess reducerade form reducerar syre direkt till peroxid och därmed ökar en annan. Ett laboratorium som undersöker mitokondriell redoxkemi och färgämnets roll som alternativ elektronväg bör därför förvänta sig probberoende svar: en superoxidkänslig avläsning sjunker medan en peroxidavläsning stiger i samma kyvett.

För det andra är peroxid i låga doser en signal, inte bara en källa till skada. Studien på hjärnmitokondrier från möss som följde på det tidigare arbetet visade peroxidbildning från så lite som femtio nanomolar färgämne utan skador på mitokondriellt DNA vid terapeutiska nivåer, med skydd mot rotenoninducerade skador efter förbehandling. Först vid hundra mikromolar, långt över det terapeutiska intervallet, skadade färgämnet vissa DNA-fragment, och rött ljus tillsammans med tjugo mikromolar färgämne bildade singlettsyre som skadade alla testade fragment. Den föreslagna mekanismen är hormetisk: en mild peroxidproduktion utlöser Nrf2-kopplade antioxidantförsvar och mitokondriell biogenes, så att en kortsiktig prooxidativ avläsning föregår ett långsiktigare antioxidativt utfall. En analys som avläses efter en timme och en som avläses efter ett dygn kan ge olika resultat eftersom biologin har förändrats däremellan.

För det tredje avgör ljuset vilken molekyl som över huvud taget finns närvarande. Belysning demetylerar färgämnet till Azure B och besläktade produkter, och mikroskoplampan över en odlingsskål räcker för att göra det fotosensibiliserande. Försök i mörker och försök under belysning är olika försök, och avsnittet om kontroller för belysning och färgämneshantering i varje protokoll bör behandla dem som sådana.

En minimiuppsättning kontroller och hur påståenden ska tolkas

Jämförelsen nedan är det ursprungliga referensmaterialet för denna artikel. Innan du accepterar ett ROS-resultat för metylenblått bör du kontrollera vilka rader författarna har täckt och vilka de har hoppat över.

Detta ger en praktisk tolkningsregel. Amplex med peroxidas, kalibrerat och kontrollerat med katalas, ger belägg om peroxid. DCFDA ger belägg om ospecifik oxidation av proben och inget mer. Spin trapping med kontroller som använder radikalfångare ger belägg om radikalens identitet. Syreupptag ger belägg om flöde. En mening som påstår mer än analysen kan stödja, oavsett hur självsäkert den är skriven, handlar om proben, inte om färgämnet. Relaterade diskussioner om dosberoende och det hormetiska intervallet, mitokondriellt elektronflöde, analysinterferens i färgade prover och artefakter från mikroskopbelysning utvecklar var och en av dessa punkter, och varje punkt förblir giltig när dess platshållarreferens har ersatts.