Loefflers alkaliska och polykroma metylenblåttfärgningar förklarade

Tre flaskor kan stå sida vid sida på en färgningsbänk, var och en märkt med någon variant av metylenblått. På en står det vattenbaserat metylenblått 1%. På en annan står det Loefflers alkaliska metylenblått. På den tredje står det polykromt metylenblått. En upptagen medarbetare tar den som står närmast. Utstryket färgas sedan för svagt, alltför jämnt blått eller i oväntade lila nyanser, och resultatet skylls på provet.

Det här är ett formuleringsproblem, inte ett provproblem. De tre lösningarna innehåller besläktade färgämnen men bygger på olika färgningsprinciper. En är ett enkelt katjoniskt färgämne vid nästan neutralt pH. En innehåller samma färgämne, vars färgningsverkan förstärkts med alkali. En är inte längre ett enda färgämne, utan en avsiktligt oxiderad blandning. Använder du fel lösning förändras själva färgningsprincipen.

Det korta svaret

Vanligt vattenbaserat metylenblått är utgångspunkten: ungefär 1% färgämne i vatten, en enkel katjonisk färgning för bakteriemorfologi och allmän mikroskopi. I Loefflers alkaliska metylenblått tillsätts en liten, uppmätt mängd utspädd alkali till en alkoholbaserad stamlösning som spätts med vatten. Det höjer pH och får det katjoniska färgämnet att binda starkare till sura bakteriestrukturer. Polykromt metylenblått är metylenblått som avsiktligt har mognats genom oxidation i alkali. Flaskan innehåller därför en blandning av demetylerade homologer (azure A, azure B, azure C), tionin och metylenviolett tillsammans med kvarvarande metylenblått, och blandningen färgar olika strukturer i olika nyanser.

Om du bara ska komma ihåg en mening: alkalisering ändrar färgningsintensiteten, medan polykromering ändrar färgningens färger.

Vanligt vattenbaserat metylenblått: referenspunkten

Den enklaste formuleringen är metylenblått löst i vatten, vanligen vid 1% w/v, utan alkali och utan oxidation. Den färgade kemiska formen är metyltioniniumkatjonen med klorid som motjon, ett litet, plant fenotiazinfärgämne som i PubChems post om metylenblått beskrivs som metyltioniniumklorid. Som katjon binder det till nukleinsyrornas fosfatryggrad och sura grupper på bakteriernas cellväggar och färgar cellerna blå mot en ljus bakgrund.

Dess fördel är förutsägbarheten. Cellkärnor och bakterier blir blå. Kontrasten är måttlig. Svagt framträdande organismer kan färgas svagt, vilket är precis den begränsning som Loeffler ville åtgärda. För den bredare grupp av enkla bakteriefärgningar som denna lösning tillhör, se en översikt över enkel bakteriefärgning. Även här är det viktigt att kontrollera färgämnets identitet: metylblått är en helt annan molekyl, vilket förklaras i metylblått jämfört med metylenblått. En katalogsökning enbart på färgnamnet kan därför ge fel färgämnesklass.

Loefflers alkaliska metylenblått: samma färgämne med förstärkt verkan

Det klassiska Loeffler-receptet kombinerar en alkoholbaserad stamlösning av metylenblått med utspädd alkali i vatten. Läroboksversioner anger 0.3 g färgämne i 30 mL 95% etanol plus 100 mL 0.01% kaliumhydroxid i vattenlösning (eller motsvarande 30 mL mättad alkoholbaserad metylenblåttlösning, 100 mL destillerat vatten och 1 mL 1% KOH). Det ger en brukslösning med omkring 0.3% färgämne vid tydligt alkaliskt pH. Kommersiella versioner följer samma princip, och Thermo Fishers katalog över mikrobiologiska färglösningar listar Loefflers alkaliska metylenblått tillsammans med polykroma och vattenbaserade varianter som separata katalogprodukter med olika avsedda användningsområden.

Alkalin är det centrala. Ett högre pH deprotonerar karboxyl- och fosfatgrupper i preparatet och ökar därmed tätheten av negativt laddade bindningsställen. Samtidigt håller den alkoholbaserade stamlösningen färgämnet helt löst, så att det når dessa ställen i monomer form. Resultatet är snabbare och intensivare bakteriefärgning än med neutralt vattenbaserat färgämne, med de välbekanta djupblå stavarna och kockerna i ett rutinmässigt bakteriologiskt utstryk. Färgningstiden är vanligen en till tre minuter, följt av sköljning med vatten.

Den klassiska tillämpningen är Corynebacterium diphtheriae odlad på Loefflers serummedium: slanka, ofta klubbformade stavar med kraftigt färgade metakromatiska Babes-Ernst-granula av lagrat polyfosfat. Kombinationen av medium och färglösning är historisk, och båda tillskrivs samma bakteriolog. Kontrasten hos granula är den diagnostiska vinsten. Utöver arbete med difteri används färglösningen som allmän bakteriologisk färgning av utstryk från odlingar, för Neisseria-morfologi i kliniska utstryk och där en gramfärgning inte behövs men vanligt vattenbaserat metylenblått ger för svag färgning. Det är en monokrom färgning. Allt som är surt får någon nyans av blått. När ett protokoll kräver särskiljande färger kan alkali ensamt inte åstadkomma det.

En praktisk varning: alkaliska färglösningar försämras och bildar fällningar vid förvaring och upptag av koldioxid. Laboratorier bereder därför antingen måttliga volymer eller köper kataloglösningen och följer dess hållbarhetstid, i stället för att fortsätta använda en gammal flaska som nu lämnar utfällningar på varje objektglas.

Polykromt metylenblått: ett namn, flera färgämnen

Polykromt metylenblått utgår från samma färgämne men utsätter det för kontrollerad oxidation i alkali, historiskt kallad mognad eller polykromering. Alkalisk åldring, upphettning med karbonat eller oxidation med ämnen som dikromat avlägsnar stegvis metylgrupper från dimetylaminosubstituenterna. Produkten är en blandning: kvarvarande metylenblått plus azure B (en metylgrupp borttagen), azure A och azure C (ytterligare demetylering), tionin (fullständigt demetylerat) och oxidativa biprodukter ur metylenviolettfamiljen. Varje komponent har sin egen färgnyans och vävnadsaffinitet, så blandningen färgar metakromatiskt: cellkärnor, granula, muciner och brosk får var för sig olika toner från blått till rödlila.

Detta är samma kemi som ligger bakom de välkända blodfärgningarna. Tidiga forskare upptäckte att alkaliserat metylenblått färgade malariaparasiternas kärnor i lila nyanser, men deras vattenbaserade, mognade lösningar var instabila och bildade fällningar inom några dagar. Översikten över hur den lila blodfärgningen uppfanns beskriver hur Malachowski och Romanowsky oberoende av varandra utnyttjade denna effekt 1891, hur metanol infördes för att stabilisera färgämnesfällningen och fixera utstryk utan värme, och hur Giemsa senare standardiserade blandningen med uppmätta mängder azure B och eosin samt stabilisering med glycerol. Moderna färglösningar av Giemsa-typ härstammar direkt från polykromt metylenblått plus eosin, kombinationen som ger Romanowsky-effekten. För mer information om kombinationen med eosin och komponenten azure B, se färgningar av Romanowsky-typ och samspelet mellan azure B och eosin.

Eftersom polykromt metylenblått är en blandning är det till sin natur den minst standardiserade av de tre. Den exakta balansen mellan färgnyanserna beror på oxidationsmetoden och oxidationens omfattning. Därför säljer histologileverantörer det som en separat produkt med egen prestandaprovning, snarare än som åldrat Loefflers metylenblått. Typiska användningsområden är metakromatisk påvisning av mastcellsgranula, muciner och brosk, framhävning av detaljer i plasmaceller samt Helicobacter pylori i vävnadssnitt med polykroma metoder av Goodpasture-typ. Det är rätt val när frågan gäller särskiljning genom färg, och fel val när protokollet förutsätter en tydlig monokrom bakteriesilhuett.

Jämförelse av formulering och användningsområde

Läs tabellen som ett beslutsstöd. Om preparatet färgas för svagt, byt pH-princip och välj Loefflers. Om allt färgas men inget går att särskilja, byt färgämnesprincip och välj polykromt metylenblått. Om ett Loeffler-färgat utstryk visar granula tydligt men handledaren frågar varför cellkärnor och cytoplasma har samma blå färg, är svaret att ingen alkalisk monokrom färgning kan särskilja dem med olika färger. Den uppgiften hör till den polykroma familjen och dess derivat för blodfärgning.

Undvik de vanliga förväxlingarna

Två misstag står för det mesta av förvirringen. Det första är att behandla Loefflers som utbytbart mot vanligt metylenblått eftersom båda ser blå ut i flaskan. De skiljer sig i pH och intensitet, och om man använder neutralt färgämne där Loefflers anges förlorar man just den granulakontrast som protokollet bygger på. Det andra är att betrakta varje gammal eller oavsiktligt åldrad alkalisk blå lösning som polykrom. Okontrollerad åldring ger en okänd blandning med okänd styrka, medan verkliga polykroma lösningar bereds med definierade oxidationsmetoder och, inom traditionen för blodfärgning, kombineras med uppmätta mängder eosin. Historien är lärorik här: de instabila vattenbaserade, mognade lösningarna från 1890-talet ersattes av metanolbaserade, stabiliserade formuleringar just eftersom okontrollerade blandningar inte kunde reproduceras. Det är en lärdom värd att minnas innan ett diagnostiskt preparat färgas med en lösning ur en flaska av okänd ålder.

Noggrannhet med benämningarna knyter ihop resonemanget. Kontrollera katalogprodukten (vattenbaserat, Loefflers eller polykromt), färgämneshalten och den avsedda användningen på etiketten i stället för att dra slutsatser utifrån färgen. De tre formuleringarna har en gemensam kromofor som ursprung. De har inte samma användningsområde.