Uji ragi ku biru métilén: ngitung sél hirup dibandingkeun jeung ngukur waktu réspirasi

Dua tabung aya dina méja laboratorium. Duanana biru. Dina hiji tabung, sél biru anu katempo dina mikroskop hartina ragi paéh. Dina tabung séjén, robahna warna tina biru jadi teu warnaan hartina ragi hirup jeung ngalakukeun réspirasi. Zat warnana sarua, tapi harti hasilna sabalikna. Lamun dua uji ieu pahili, unggal kacindekan ogé bakal tibalik.

Bédana éta anu jadi inti artikel ieu. Biru métilén nyaéta zat warna rédoks: dina kaayaan teroksidasi warnana biru, dina kaayaan tereduksi jadi leukométilén biru anu teu warnaan. Cacah viabilitas ngamangpaatkeun kimia éta dina pangamatan mikroskopis singget. Ékspérimén réspirasi ngamangpaatkeunana dina réaksi sakabéh campuran anu waktuna diukur. Masing-masing merlukeun protokol sorangan, kontrol sorangan, jeung sikep kritis sorangan.

Cacah viabilitas: pewarnaan pondok, geura baca hasilna

Protokol gaya pabrik bir nyaéta vérsi anu pangstandarna. Siapkeun biru métilén 0.01% w/v dina natrium sitrat 2%, campurkeun 1:1 jeung suspénsi ragi, tuluy pariksa campuran sanggeus selang waktu pondok anu geus ditangtukeun. Selang waktu dina publikasi rupa-rupa, ti 1 nepi ka 2 menit dina buku pituduh Brewing Science Institute nepi ka kira-kira 5 menit dina protokol panalungtikan, ari métode mikrobiologi anggur OIV merlukeun pamariksaan dina waktu 10 menit. Konséntrasi zat warna dina campuran pikeun cacah ahirna deukeut 0.005%. Eusian kamar Neubauer anu disampurnakeun, tuluy dina pembesaran kira-kira 400x golongkeun sél biru poék salaku teu viabel jeung sél anu teu kawarnaan salaku viabel. Dina métode OIV, sél biru ngora diitung salaku hirup, anu geus nuduhkeun masalah subjéktivitas anu dibahas di handap.

Konséntrasi sél ditangtukeun tina géométri kamar. Lamun sakabéh pasagi tengah 1 mm diitung, jumlah sél per mL sarua jeung N dikali faktor éncéran dikali 10^4, kalayan N minangka cacah dina aréa éta, sakumaha dijelaskeun dina métode ragi ASBC. Viabilitas leuwih basajan: sél anu teu kawarnaan dibagi jumlah sakabéh sél, dikali 100. Itung kira-kira 400 sél pikeun ngira-ngira viabilitas, nuturkeun studi babandingan di pabrik bir FEMS jeung prakték OIV. Paké hiji aturan wates sacara konsistén, contona kaasupkeun sél dina garis kisi handap jeung kénca, sarta ulah kaasupkeun anu dina garis luhur jeung katuhu.

Aturan pikeun kuncup kudu ditangtukeun saméméh cacah dimimitian. Kabiasaan anu ilahar nyaéta ngitung kuncup salaku sél misah lamun ukuranana geus ngahontal kira-kira satengah ukuran sél indung, sarta ngitungna babarengan jeung indung lamun leuwih leutik ti éta. Naon waé aturan anu dipilih, larapkeun kana unggal pasagi jeung tuliskeun dina lembar kerja sangkan jalma saterusna ngalakukeunana ku cara anu sarua.

Lembar kerja cacah (citak ieu)

Lembar kerja ieu mangrupa bahan asli pikeun artikel ieu. Salin kana buku catetan atawa citak hiji pikeun unggal sampel.

Viabilitas (%) = 100 x teu kawarnaan / (teu kawarnaan + biru poék). Jumlah sakabéh sél per mL = N x faktor éncéran x 10^4, kalayan N tina aréa kamar anu geus ditangtukeun. Catet selang waktu pewarnaan di gigireun hasilna, sabab angka viabilitas tanpa katerangan waktuna teu bisa dihasilkeun deui sacara konsistén.

Naha angka viabilitas bisa robah

Waktu nyaéta gangguan kahiji, sarta pangaruhna bisa ka dua arah. Sél anu aktif sacara métabolik ngaréduksi zat warna, jadi maca hasil teuing awal bisa manggihan sél hirup saméméh réngsé ngaréduksi zat warna sarta salah ngagolongkeunana salaku paéh. Tapi paparan anu lila sorangan boga sipat toksik sarta nyiptakeun sél biru anu bener-bener ruksak, sahingga pewarnaan bisa salah nunjukkeun sél anu ti heula geus paéh. Ku kituna, hiji protokol pangajaran laboratorium nangtukeun yén penilaian kudu dipigawé dina waktu 5 menit, sakumaha didokuméntasikeun dina protokol pangajaran ragi Wisconsin. Rumusan anu aman nyaéta yén penilaian ku biru métilén gumantung kana waktu, jadi tangtukeun hiji selang waktu pondok sarta jaga tetep sarua pikeun unggal sampel dina hiji runtuyan.

Sampel anu viabilitasna handap mawa bias kadua. Métode anu distandardisasi ngingetkeun yén biru métilén bisa ngira viabilitas sabenerna leuwih luhur dina nilai di handapeun kira-kira 80%, sabab sél anu masih bisa ngaréduksi zat warna can tangtu masih miboga kamampuh baranahan. Literatur ngeunaan pembuatan bir ngajelaskeun kateuandalan anu sarua lamun viabilitas geus turun pisan. Anggap biru métilén minangka perkiraan kasar anu gancang, sarta pastikeun kaputusan penting ngeunaan viabilitas handap, saperti ngagunakeun deui kultur pikeun inokulasi, ku cacah dina cawan atawa pewarnaan panglengkep.

Pangaruh matriks jadi gangguan katilu. Métode OIV dilakukeun deukeut pH 4.6 sarta ngingetkeun yén sampel pH handap anu miboga panyangga kuat nyegah zat warna jalan sakumaha mistina. Métode ieu ogé nyarankeun ulah ngalakukeun uji lamun gula ngaleuwihan 100 g/L, sabab sél katempo biru ngora anu nyasabkeun. Babandingan ékspériméntal pH pewarnaan manggihan parobahan sensitipitas anu gedé dina rentang anu diuji, luyu jeung studi métode biru métilén anu gumantung kana pH. Rémah nyaéta jebakan séjén: partikel anu kawarnaan dina bubur bahan bir anu kotor nyarupaan sél paéh sarta ngagedékeun variasi hasil antaroperator.

Variasi éta geus diukur, lain ukur carita pangalaman. Dina uji pabrik bir salila genep bulan anu dilaporkeun dina babandingan ragi FEMS, pangukuran biru métilén duplikat miboga simpangan baku rata-rata 6.1%, dibandingkeun jeung 0.2% pikeun sitométri aliran oxonol, kalayan hasil dua operator béda nepi ka 13 poin perséntase dina sampel anu sarua. Hiji babandingan kuantitatif métode viabilitas taun 2023 manggihan yén mikroskopi fluoresénsi jeung sitométri aliran jauh leuwih présisi, bari némbongkeun yén kinerjana gumantung kana spésiés jeung matriks. Pedaran métode klasik ku Painting jeung Kirsop (PMID 24430080) tetep jadi rujukan, sarta tinjauan uji viabilitas jeung vitalitas ragi anu leuwih lega (PMID 25154541) nempatkeun biru métilén minangka uji panglengkep, lain uji anu mutlak nangtukeun hasil. Biru tripan henteu otomatis jadi pilihan anu leuwih hadé di dieu: éta nunjukkeun leungitna integritas mémbran, ari biru métilén nunjukkeun asupna zat warna ditambah aktivitas réduksi, jadi sél anu ngalaman strés bisa kagolongkeun béda ku dua zat warna éta.

Ékspérimén réspirasi: ukur waktu leungitna warna biru

Uji kadua henteu maké mikroskop pisan. Ragi ditambah glukosa ditambah biru métilén éncér diasupkeun kana tabung katutup, sarta jam ngukur sabaraha lila warna biru ngaleungit. Nalika sél ngalakukeun métabolisme, sél ngahasilkeun ékuivalén réduksi anu ngarobah zat warna biru jadi wangun anu teu warnaan, ari oksigén anu leyur ngoksidasi deui zat warna éta. Sanggeus sél nurunkeun kadar oksigén, réduksi neto leuwih dominan sarta warna dina tabung ngaleungit. Ku kituna, titik ahir ngagambarkeun kasaimbangan réspirasi, konséntrasi zat warna, jeung kasadiaan oksigén, sarta kudu dilaporkeun salaku waktu réduksi atawa leungitna warna biru métilén, lain salaku laju konsumsi oksigén molekular sacara langsung.

Paké zat warna anu jauh leuwih éncér tibatan dina uji viabilitas sangkan waktuna aya dina rentang anu merenah. Buku pituduh praktikum wajib AQA A level ngabakukeun ieu kalayan hadé: 1 g glukosa per 100 mL cai anu dihaneutan nepi ka kira-kira 30 C, 5 g ragi garing ditambahkeun pas saméméh dipaké, sarta larutan kerja zat warna deukeut 0.001% disiapkeun ku ngéncérkeun 0.1 mL larutan stok 1% nepi ka 100 mL. Campurkeun 2 mL suspénsi ragi-glukosa jeung 2 mL larutan kerja zat warna, antepkeun nepi ka suhuna saimbang jeung suhu uji, kocok sakali salila 10 detik, mimitian pangukur waktu, sarta ulah dikocok deui. Ngocok ngasupkeun deui oksigén sarta ngajadikeun tabung biru deui, anu mangrupa artéfak prosedur panggedéna. AQA nyatet yén warna préparasi biasana kudu ngaleungit dina kira-kira 5 menit dina 35 C, kalayan rata-rata uji 275 s dina 20 C, 128 s dina 35 C, jeung 145 s dina 45 C. Éta téh conto tina hiji susunan ékspérimén, lain patokan universal. Hubungan kuantitatif antara laju réduksi jeung ragi anu aktif sacara métabolik dina kaayaan anu dikontrol dirojong ku studi husus ngeunaan réduksi, kaasup karya anu diindéks salaku PMID 25773544 jeung studi mékanistik dina Yeast (2014).

Démonstrasi runtuyan waktu (bahan asli)

Tabél di handap mangrupa démonstrasi asli anu dijieun pikeun artikel ieu maké susunan gaya AQA anu dijelaskeun di luhur: 2 mL campuran ragi-glukosa ditambah 2 mL larutan kerja zat warna deukeut 0.001%, dikocok sakali salila 10 detik, tuluy diinkubasi tanpa diganggu. Eusina mangrupa conto hasil bacaan dina format anu kudu dicatet ku kelompok murid, kalayan indéks laju dihartikeun salaku 1 dibagi waktu leungitna warna dina detik. Laksanakeun uji dina tabung anu sarua sarta ganti eusi ieu ku nilai hasil pangukuran.

Jieun grafik indéks laju ngalawan suhu pikeun tabung A, B, jeung C. Kurvana naék tuluy ngadatar atawa turun, anu mangrupa pola anu dipiharep tina prosés anu didorong ku énzim, lain garis lempeng. Tabung D, E, jeung F lain titik data dina kurva éta. Éta téh kontrol anu ngajadikeun kurva bisa ditafsirkeun.

Kontrol anu ngajadikeun unggal uji boga harti

Unggal runtuyan uji réspirasi merlukeun tilu pangiring. Ragi anu digodog atawa dipaéhan ditambah glukosa ditambah zat warna kudu tetep biru, ngabuktikeun yén réduksi gancang gumantung kana métabolisme anu hirup. Ragi hirup ditambah zat warna tanpa tambahan glukosa nyaéta kontrol substrat, tapi tetep antisipasi warna leungit lalaunan sabab ragi ngagunakeun cadangan éndogén. Glukosa ditambah zat warna tanpa ragi nyaéta blanko kimia, anu penting sabab glukosa dina kaayaan basa bisa ngaréduksi biru métilén tanpa ayana sél.

Cacah viabilitas merlukeun jinis kontrol anu béda: konsisténsi prosedur. Larutan stok zat warna anu sarua, babandingan campuran anu sarua, selang waktu pewarnaan anu sarua, aréa kamar anu sarua, aturan kuncup jeung wates anu sarua, sarta cacah tanpa nyaho idéntitas sampel lamun bisa. Lamun hasil dua operator béda sapuluh poin, lembar kerja biasana némbongkeun panyababna: waktu anu béda, ambang warna biru anu béda, atawa aturan kuncup anu béda. Téhnik nyiapkeun jeung ningali sél anu kawarnaan patali jeung métode pewarnaan basajan baktéri, ari tinjauan anu leuwih lega ngeunaan naon anu ditandaan ku zat warna ieu dina rupa-rupa spésimén aya dina atlas pewarnaan mikroskopi. Pikeun dasar fisika dina maca inténsitas biru naon waé sacara kuantitatif, rujukan absorpsi anu dilengkepan katerangan kaayaan ngajelaskeun naha unggal koéfisién kudu dibarengan ku kaayaan pangleyur, pH, jeung konséntrasina.

Pilih uji dumasar kana patalékan. Sabaraha sél anu hirup ayeuna nyaéta patalékan cacah, dijawab dina mikroskop maké lembar kerja. Sakumaha aktif kultur ieu ngalakukeun réspirasi nyaéta patalékan kinétik, dijawab maké stopwatch jeung tabung anu dikontrol. Biru métilén bisa dipaké pikeun duanana, tapi ulah kungsi dina tabung anu sarua dina waktu anu sarua.