Métilén bulao pikeun ngawarnaan DNA jeung RNA: aplikasi dina gel jeung mémbran

Hiji mahasiswa ngajalankeun gel agarosa, ngawarnaanana ku métilén bulao, tuluy teu ningali nanaon di tempat anu dipiharep aya pita caang. Di méja gigireunana, panalungtik pascadoktoral ngawarnaan mémbran Northern ku botol zat warna bulao anu sarua sarta meunang pita ribosomal anu écés dina tilu menit. Mahasiswa éta nyimpulkeun yén gelna gagal. Gelna henteu gagal. Dua pancén éta béda, sarta zat warna anu sarua ngajawabna ku sénsitipitas anu béda, latar anu béda, jeung aturan anu béda pikeun prosés satuluyna.

Zat warna DNA métilén bulao jeung ngawarnaan RNA ku métilén bulao miboga kimia anu sarua, tapi tujuanana henteu sarua. Dina gel, zat warna némbongkeun sabaraha loba asam nukléat anu aya dina matriks pori. Dina mémbran, zat warna némbongkeun naha transfer hasil jeung naha unggal lajur dieusian sacara rata. Sanggeus bédana écés, protokol, wates detéksi, jeung wates kasaluyuan jadi leuwih gampang kaharti.

Jawaban singget

Métilén bulao téh zat warna kationik planar anu ngabeungkeut asam nukléat sacara nonkovalén jeung réversibel, ngaliwatan gabungan tarikan éléktrostatik kana fosfat, interkalasi di antara pasangan basa, jeung asosiasi jeung alur leutik. Sipat réversibel éta anu jadi koncina. Pita bisa diwarnakeun sarta ditempo ku cahaya katempo, didokuméntasikeun, tuluy warnana dileungitkeun atawa dibersihan pikeun kloning, hibridisasi, atawa probing ulang.

Pikeun ngawarnaan DNA untaian ganda dina gel agarosa ku métilén bulao, resep gancang standar nyaéta 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) dina cai, ngawarnaan kira-kira 15 menit ditambah ngaleungitkeun warna ku cai kira-kira 15 menit, tuluy ditingali dina kotak cahaya bodas. Pikeun mémbran, resep klasik blot Northern nyaéta zat warna 0.02 nepi ka 0.04 percent dina natrium asétat deukeut pH 5.2, ngawarnaan sababaraha menit sanggeus transfer jeung imobilisasi, tuluy dikumbah ku cai sarta warnana dileungitkeun sagemblengna saméméh hibridisasi. Sénsitipitasna kawates: puluhan nepi ka ratusan nanogram per pita gel dina kaayaan anu hadé, sarta pituduh konservatif nyebutkeun 0.5 nepi ka 1 microgram. Éta sababaraha orde magnitudo leuwih luhur tibatan étidium bromida jeung zat warna SYBR. Dina mémbran, teu aya hiji wates detéksi transkrip tunggal anu mangpaat sabab zat warna utamana némbongkeun RNA ribosomal anu loba jeung total bahan anu dimuat. Ulah ngaganti bahan dina salah sahiji resep ku larutan suplemén éceran. Métode anu geus divalidasi nganggap yén anu dipaké téh zat warna kelas analitik, bufer anu ditangtukeun, jeung penanganan bébas RNase lamun ngalibetkeun RNA.

Kumaha pangbeungkeutan lumangsung, jeung di mana éta bisa nyasabkeun

Modél anu mangpaat miboga tilu bagian. Kahiji, sistem cingcin anu muatanana positif katarik ku rangka fosfat anu muatanana négatif. Panalungtikan spéktroskopi manggihan yén komponén éléktrostatik ieu dominan dina kadar uyah anu handap, sedengkeun pamodélan jeung dinamika molekular tetep némbongkeun interkalasi jeung pangbeungkeutan dina alur leutik minangka modeu anu stabil pikeun DNA untaian ganda, sakumaha diringkeskeun dina panalungtikan spéktroskopi ngeunaan pangbeungkeutan métilén bulao kana DNA. Kadua, aya sababaraha karesep kana GC, kalayan pamodélan leuwih milih léngkah CpG jeung GpC sarta ékspérimén ngalaporkeun asosiasi anu leuwih dipikaresep jeung dupleks beunghar GC dina panalungtikan ngeunaan karesep interkalasi métilén bulao, tapi dupleks AT ogé ngabeungkeut. Ngawarnaan rutin henteu spésifik kana runtuyan. Katilu, DNA untaian tunggal jeung RNA ngabeungkeut utamana ngaliwatan éléktrostatika jeung tumpukan jeung basa anu bisa diaksés sarta wewengkon dupleks. Éta sababna kuatna warna rupa-rupa gumantung kana panjang, runtuyan, jeung struktur sékundér.

Aya dua akibatna. Ku sabab pangbeungkeutanana nonkovalén, zat warna bisa leungit nalika dikumbah. Pita poliakrilamida gancang luntur lamun henteu ngahaja difiksasi, sarta varian husus fiksasi permanén aya lantaran ngawarnaan biasa sipatna samentara, sakumaha dijelaskeun ku Soto jeung Draper pikeun gel PAGE. Ku sabab zat warna téh fotosénsitiser, paparan cahaya caang anu lila kana DNA anu geus diwarnakeun dina ayana oksigén bisa ngoksidasi guanin sarta ahirna nyieun pegat leutik dina untaian, mékanisme anu dipedar dina panalungtikan ngeunaan oksidasi guanin anu disénsitisasi ku métilén bulao. Ningali sakeudeung ku cahaya bodas nyingkahan karuksakan UV anu geus dipikawanoh dina alur gawé klasik étidium bromida, sarta kaunggulan éta nyata pikeun meunangkeun deui DNA dina prosés préparatif. Cahaya katempo leuwih hampang pangaruhna, lain hartina henteu ngabahayakeun. Singgetkeun waktu pencahayaan lamun DNA rék dikloning. Pikeun fotokimia anu leuwih lega di balik ieu panginget, tingali dua jalur dina fotokimia métilén bulao. Pikeun pasangan rédoks jeung kaayaan muatan anu ngajelaskeun naha bentuk teroksidasi ngabeungkeut sarta bentuk teréduksi henteu, tingali kimia struktur jeung sipat métilén bulao.

Pancén kahiji: ngawarnaan dina gel

Ngawarnaan gel ngajawab hiji patalékan: naha asam nukléat dina ieu pita cukup loba pikeun katempo ku panon. DNA untaian ganda dina agarosa nyaéta kasus anu panglengkepna dikarakterisasi. Métode gel métilén bulao asli ti Flores jeung batur sapagaweanana ngavalidasi protokol gancang 0.02 percent dina agarosa 1 percent sarta némbongkeun yén DNA bisa hasil dicokot deui jeung dikloning sanggeusna. Protokol anu sarua ti panyadia aya dina kaca produk métilén bulao IBI Scientific, anu nampilkeun resep mémbran 0.04 percent jeung varian gel gancang babarengan.

Alur gawé praktis:

1. Jalankeun gel saperti biasa. Warnakeun sanggeus éléktroforésis, lain nalika lumangsung, kajaba transfer atawa résolusi geus divalidasi pikeun métode anu dirobah.
2. Rendam dina métilén bulao 0.02 percent w/v dina cai suling, bari digoyangkeun lalaunan, kira-kira 15 menit.
3. Leungitkeun warna ku sababaraha kali ngaganti cai, total kira-kira 15 menit, nepi ka latar matriks ngurangan sarta pita katempo écés.
4. Geura potret dina alat pencahaya bodas.

Agarosa jeung poliakrilamida miboga paripolah anu béda. Agarosa nahan zat warna dina matriks, jadi ngaleungitkeun warna téh léngkah anu lambat. Gel poliakrilamida ipis gancang diwarnakeun tapi ogé gancang kaleungitan warna, anu mantuan pemotongan préparatif tapi ngaganggu rékaman arsip. Oligonukléotida sintétik dina poliakrilamida bisa dipaluruh tempatna ku resep 0.02 percent anu sarua dina 20 nepi ka 30 menit kalayan kumbahan cai sababaraha kali, nurutkeun métode PAGE gaya Current Protocols anu geus mapan. Varian anu kacida éncérna, deukeut 0.0002 percent dina TBE éncér, geus dilaporkeun pikeun oligo préparatif salila sababaraha jam, tapi dasar buktina leuwih lemah.

Bédana DNA jeung RNA penting. DNA untaian ganda méré pangbeungkeutan terstruktur anu pangkuatna. RNA jeung DNA untaian tunggal bisa diwarnakeun, tapi leuwih lemah sarta leuwih hésé diprediksi. Pikeun gel RNA agarosa formaldehida, lolobana laboratorium henteu ngalakukeun ngawarnaan bulao dina gel sarta mindahkeun RNA kana mémbran heula, tuluy ngawarnaan di dinya. Cara éta ngaganti sinyal gel anu lemah ku sinyal mémbran anu leuwih écés ditambah rékaman muatan sampel.

Pancén kadua: ngawarnaan dina mémbran

Ngawarnaan mémbran ngajawab patalékan anu béda: naha transfer hasil, jeung naha lajurna bisa dibandingkeun. Aplikasi klasikna nyaéta ngawarnaan blot Northern réversibel Herrin jeung Schmidt, mimitina maké zat warna 0.04 percent dina natrium asétat 50 mM dina pH 5.0 salila 2 nepi ka 3 menit dituturkeun ku kumbahan cai, sarta bisa dileungitkeun ku SDS éncér dina SSPE saméméh hibridisasi.

Varian modéren anu loba dipaké lumangsung kieu:

1. Transfer RNA atawa DNA anu geus didénaturasi kana nilon atawa nitrosélulosa, tuluy imobilisasi ku pangiketan silang UV atawa pemanasan sangkan sampel henteu leungit nalika ngawarnaan.
2. Pilihan tapi ilahar: baseuhan mémbran dina asam asétat 5 percent salila kira-kira 15 menit.
3. Warnakeun salila 5 nepi ka 10 menit dina métilén bulao 0.02 nepi ka 0.04 percent dina natrium asétat 0.3 nepi ka 0.5 M deukeut pH 5.2.
4. Kumbah sarta leungitkeun warna dina cai salila 5 nepi ka 15 menit, dokuméntasikeun, tuluy singkirkeun sésa zat warna saméméh hibridisasi.

Nilon anu muatanana positif panglobana dipaké dina pagawéan Northern. Nitrosélulosa ogé bisa dipaké kalayan alur gawé asam asétat ditambah asétat anu sarua. Gambarna dipaké pikeun mastikeun transfer, ngabandingkeun pita 28S jeung 18S (atawa 23S jeung 16S pikeun RNA baktéri), nandaan ladder jeung standar, sarta nyimpen rékaman kasar normalisasi total RNA. Métode Northern anu geus dipublikasikeun ngukur pita ribosomal anu diwarnakeun pikeun mariksa muatan sampel, kaasup panalungtikan élmu susu anu maké pita ribosomal métilén bulao pikeun normalisasi. Mémbran Southern bisa divisualisasikeun ku cara anu sarua, tapi zat warna ieu jauh leuwih mapan minangka pamariksaan muatan jeung transfer Northern. DNA Southern ogé didénaturasi saméméh transfer, jadi angka sénsitipitas gel henteu bisa langsung diterapkeun.

Wates detéksi jeung latar: di mana zat warna bulao éléh

Babandingan di handap ngahaja dijieun mangrupa perkiraan. Kinerja zat warna gumantung kana perséntase gel, lébar pita, optik, jeung katartiban ngaleungitkeun warna. Anggap unggal angka minangka orde magnitudo, lain spésifikasi.

Kontrol latar nangtukeun naha sinyal anu kawates bisa dipaké. Zat warna bébas miboga warna anu kacida kuatna, jadi kontras asalna tina ngaleungitkeun zat warna anu henteu kabeungkeut tanpa ngaleupaskeun zat warna anu kabeungkeut. Zat warna anu leuwih kentel jarang nambahan sénsitipitas. Utamana éta nambahan waktu pikeun ngaleungitkeun warna. Jalankeun runtuyan pangéncéran dina gel, mémbran, jeung kaméra anu rék dipaké, sarta paké ngan rentang anu dénsitas terintegrasina tetep sabanding jeung jumlah bahan asup. Métilén bulao ngarojong normalisasi muatan sacara semikuantitatif. Éta lain uji kuantitatif kalayan rentang dinamis anu luhur sabab kapasitas mémbran, éfisiénsi transfer, saturasi, jeung ngaleungitkeun warna rupa-rupa ti hiji lajur ka lajur séjén.

Wates kasaluyuan: naon anu tetep bisa dipaké sanggeus ngawarnaan

Kloning sanggeus ngawarnaan bulao geus dibuktikeun. Flores jeung batur sapagaweanana motong pita agarosa anu geus diwarnakeun, nyokot deui DNA, tuluy ngaligasi jeung ngalakukeun transformasi, sarta ngalaporkeun kloning anu leuwih hadé tibatan sanggeus étidium bromida kalayan UV. Alesan anu paling mungkin nyaéta karuksakan ku cahaya anu leuwih saeutik, lain mangpaat tina zat warna sorangan. Singgetkeun paparan cahaya bodas sarta bersihan DNA anu dicokot deui ngaliwatan prosedur ekstraksi gel biasa.

Bukti pikeun PCR jeung sekuensing leuwih kawates. Sésa zat warna ngabeungkeut asam nukléat, jadi leungitkeun warna sarta bersihan saméméh léngkah énzimatik. DNA tina gel bulao anu dimurnikeun kalayan leres dipiharep bisa dipaké, tapi toleransi kana zat warna anu langsung kabawa pikeun rupa-rupa polimérase jeung kimia sekuensing tacan diukur kalayan hadé. Ulah nganggap éta geus pasti.

Hibridisasi blot cocog lamun runtuyanana dipatuh kalayan ketat: transfer, imobilisasi, ngawarnaan, ngadokuméntasikeun, ngaleungitkeun warna, hibridisasi. Runtuyan éta nyaéta rancangan Herrin jeung Schmidt. Ngawarnaan saméméh transfer, atawa ngalangkungan ngaleungitkeun warna, mangrupakeun métode anu béda sarta merlukeun validasi sorangan. Sanggeus zat warna dileungitkeun, ngaleupaskeun probe jeung probing ulang standar bisa lumangsung saperti biasa. Pikeun ngawarnaan dina tingkat sél ku kulawarga zat warna anu sarua sarta naha logika préparat anu difiksasi henteu bisa diterapkeun kana métode sél hirup, tingali atlas ngawarnaan mikroskopi.

Pemotongan pita bisa dipaké pikeun agarosa préparatif jeung oligo PAGE anu tempatna dipaluruh ku zat warna bulao, asal varian fiksasi permanén henteu dipaké. Éléktroélusi sanggeus ngaleungitkeun warna masuk akal sacara kimia pikeun zat pangbeungkeut réversibel, tapi data hasil anu dikontrol husus pikeun métilén bulao masih saeutik. Leungitkeun uyah atawa éndapkeun sanggeus élusi.

Kagagalan anu mindeng kajadian

Pita gel anu samar biasana hartina massana saeutik teuing pikeun zat warna kolorimétrik, utamana pikeun target untaian tunggal pondok atawa RNA. Tambahkeun muatan, paké zat warna anu seger, manjangkeun waktu ngawarnaan saméméh naékkeun konséntrasi, sarta eureun ngaleungitkeun warna leuwih awal. Gel bulao pekat tanpa kontras biasana hartina kaleuleuwihi ngawarnaan atawa kurang mindeng ngaganti cai. Pita PAGE anu luntur téh paripolah kimia anu dipiharep, lain ngawarnaan anu gagal. Geura potret. Latar mémbran anu henteu rata nunjukkeun tilepan, gelembung, tapak ramo, panggoyangan anu henteu rata, atawa transfer anu henteu rata. Ulah nafsirkeun éta minangka muatan anu henteu sarua tanpa kontrol hibridisasi. Pola ribosomal anu lemah jeung ngabur bisa hartina dégradasi, tapi ogé bisa lantaran transfer anu henteu lengkep, total RNA saeutik teuing (lajur ilaharna ngandung sababaraha nepi ka puluhan microgram), atawa kaleuleuwihi ngaleungitkeun warna. Zat warna némbongkeun RNA ribosomal anu loba. Éta henteu némbongkeun transkrip husus. Éta pancén probe.

Kasalametan jeung penanganan tanpa klaim kaleuleuwihi

Métilén bulao leuwih gampang diurus tibatan étidium bromida, tapi lain hartina henteu ngabahayakeun. Lembar data kasalametan MilliporeSigma ayeuna ngagolongkeun zat warna ieu kana toksisitas oral akut Kategori 4, ngabahayakeun lamun katelek, sarta kudu dipiceun ngaliwatan jalur limbah anu disatujuan nurutkeun SDS métilén bulao Sigma-Aldrich. Étidium bromida miboga peringatan génotoksisitas anu leuwih kuat, kaasup pangaruh kana sél germinal anu disangka aya dina SDS étidium bromida Sigma-Aldrich, sarta gel jeung larutanana ilahar dipisahkeun minangka limbah kimia ngabahayakeun, sakumaha dicatet dina pituduh zat warna asam nukléat Thermo Fisher. Turutan SDS jeung aturan lembaga pikeun duanana. Simpen zat warna garing dina wadah anu ditutup pageuh sarta tetep garing, paké deui larutan zat warna gawé ngan lamun diidinan ku protokol, simpen mémbran anu geus diwarnakeun dina kaayaan garing di antara lambaran kertas saring, sarta potret gel saméméh pitana sumebar ku difusi.

Inget kalimah pikeun méja laboratorium ieu. Gel nguji katémbongna dina muatan luhur dina cahaya bodas. Mémbran nguji transfer jeung muatan saméméh probe ngalakukeun pagawéan anu sénsitip. Hiji zat warna ngalayanan duanana, kalayan sénsitipitas anu kawates, pangbeungkeutan réversibel, jeung runtuyan léngkah anu ketat.