Novo metilensko modrilo in barvanje retikulocitov: ločeno barvilo in metoda za žive celice

Študent se pripravlja na štetje retikulocitov, naroči metilensko modrilo, ga zmeša s krvjo in ne vidi skoraj ničesar. Sošolec uporabi stekleničko z oznako novo metilensko modrilo in v delu eritrocitov opazi jasno izražene modre nitke. Prvi študent domneva, da je vsebina druge stekleničke bolj sveža ali bolj koncentrirana. Ni ne eno ne drugo. Vsebuje drugačno molekulo.

Ta pojmovna napaka je vzrok za večino zmede na tem področju. Ime nakazuje, da je novo metilensko modrilo izboljšana serija metilenskega modrila. Kemija pravi drugače. Novo metilensko modrilo N je ločeno fenotiazinsko barvilo z lastno številko Colour Index, lastnim vzorcem substitucije in lastno standardizirano vlogo v hematologiji. Ko je ta razlika jasna, postane razumljiv tudi preostanek metode: zakaj morajo biti celice med barvanjem žive, kaj šteje kot retikulocit, kam sodijo Heinzova telesca in kdaj pride v poštev briljantno krezilno modrilo.

Kratek odgovor

Novo metilensko modrilo N, hematološki reagent, je običajno opredeljeno kot Basic Blue 24 v zapisu PubChem za novo metilensko modrilo, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, s formulo C18H22ClN3S. Običajno metilensko modrilo je metiltioninijev klorid, Basic Blue 9, v svojem zapisu PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, s formulo C16H18ClN3S. Strukturno ima novo metilensko modrilo dve metilni skupini na obroču in etilaminske stranske verige tam, kjer ima metilensko modrilo dimetilaminske skupine. Ta razlika spremeni lastnosti barvanja. Hematološka literatura opisuje običajno metilensko modrilo kot razmeroma slabo barvilo za retikulocite, novo metilensko modrilo pa kot barvilo, ki obarva intenzivneje in bolj enakomerno. Primerjava je povzeta v tematskem pregledu o novem metilenskem modrilu na ScienceDirect.

Da, novo metilensko modrilo je supravitalno barvilo. Supravitalno barvanje pomeni barvanje živih celic po odvzemu iz telesa in pred fiksacijo, kot je opredeljeno v pregledu načel supravitalnega barvanja na NCBI. V to skupino sodita tako novo metilensko modrilo kot briljantno krezilno modrilo, standard CLSI za retikulocite pa novo metilensko modrilo izrecno obravnava kot supravitalno barvilo. Študenti ga včasih uvrstijo k barvanju fiksiranih razmazov po Romanowskem. Takšna predstava tu ne ustreza. Če najprej fiksirate celice, metoda ne deluje več.

Za bralce, ki primerjajo podobna imena barvil, članek metilno modrilo v primerjavi z metilenskim modrilom obravnava drugo, širšo zmedo med anionskim triarilmetanskim barvilom in kationsko fenotiazinsko skupino. Pregled laboratorijskega barvanja umesti supravitalno barvanje med metode s fiksiranimi razmazi, vodnik po morfologiji krvnih celic pa pokaže, kam sodi ocenjevanje retikulocitov v širšem okviru diferencialne krvne slike.

Opozorilo glede katalogov: obstaja tudi ločena oblika novega metilenskega modrila kot dvojna sol s cinkovim kloridom pod CAS 6586-05-6. Zato je treba v razdelku o metodah navesti obliko soli in dobavitelja, ne le običajnega imena.

Kaj supravitalno barvanje dejansko naredi

Retikulocit je mlad eritrocit, ki je izgubil jedro, vendar še vsebuje preostalo ribosomsko RNA. V neobarvanem mokrem preparatu ta RNA ni vidna. Supravitalno barvilo vstopi v živo celico in to RNA obori ali združi v modra zrnca in nitke, torej retikulofilamentozni material, viden pri mikroskopiranju z oljno imerzijo. Mreža je zato produkt barvanja, ne vnaprej oblikovano ogrodje, ki čaka na barvo. Zato so spremenljivke protokola, kot so koncentracija barvila, pufer, razmerje med krvjo in barvilom, temperatura ter čas, enako pomembne kot ime barvila.

Praktična posledica je strogo zaporedje korakov: najprej zmešajte kri z antikoagulantom in barvilo, inkubirajte, nato pripravite razmaze in jih preglejte nefiksirane ter brez kontrastnega barvanja. Fiksacija pred barvanjem ali kontrastno barvanje, ki zakrije šibko vidne nitke, uniči informacije, od katerih je odvisno štetje.

Praktični protokol za retikulocite z novim metilenskim modrilom

Enotna univerzalna sestava reagenta ne obstaja, zato navedite uporabljeno sestavo. Tri dokumentirane različice prikazujejo razpon možnosti.

Klasični postopek po Brecherju uporablja približno 0.5 odstotka novega metilenskega modrila s kalijevim oksalatom, zmešanega v enakih volumnih z dobro premešano krvjo z EDTA, nato pa približno 10 do 15 minut inkubacije pri sobni temperaturi. Po nežnem ponovnem mešanju se pripravijo tanki klinasti razmazi, posušijo na zraku in pregledajo nefiksirani s 100x oljnim imerzijskim objektivom. Postopek štetja retikulocitov na NCBI opisuje ta potek in okvir za štetje, ki se pri njem uporablja.

Različica po Dacieju in Lewisu uporablja 1.0 odstotka novega metilenskega modrila v citratni fiziološki raztopini, zmešanega z 2 do 4 volumni krvi in inkubiranega pri 37 C za 15 do 20 minut pred pripravo razmazov. Nedavna izvedba usklajevanja postopka CLSI H44 je uporabila manj koncentrirano, 0.1-odstotno raztopino v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom pri pH 7.4, z inkubacijo pri 20 C za 10 minut in brez fiksacije, kot poroča študija usklajevanja NMB iz leta 2026.

Pravila štetja so skupna vsem različicam. Celico opredelite kot retikulocit, kadar vsebuje vsaj dve ločeni modro obarvani zrnci ali odseka nitk, s čimer izključite osamljene usedline barvila. Pri rutinskem delu preštejte vsaj 1,000 eritrocitov in retikulocite navedite kot odstotek. Pri nizkih odstotkih statistika zahteva več celic. Pregled metodologije CLSI H44 navaja, da je pri približno 1 odstotku retikulocitov potrebnih približno 4,400 celic, da se variabilnost štetja zmanjša na 5 odstotkov; to je opisano v pregledu CLSI H44 pri De Gruyter. Millerjev okularni disk omogoča praktično izvedbo obsežnega štetja. Barvilo filtrirajte ali ga pripravite svežega, ker oborina posnema zrnate vključke.

Heinzova telesca v istem preparatu

Isti supravitalno obarvani razmaz lahko prikaže tudi Heinzova telesca, ki so skupki oksidiranega in denaturiranega hemoglobina, ne pa preostala RNA. V preparatih z novim metilenskim modrilom so vidna kot okrogla telesca, pogosto posamična in blizu membrane, obarvana svetleje modro kot retikulofilamentozni material. Pri fiksaciji in kontrastnem barvanju se slabo ohranijo, zato preglejte nefiksiran razmaz. Nedavni protokol z 20 mikrolitri krvi z EDTA, 20 mikrolitri 1-odstotnega novega metilenskega modrila in 15 minutami inkubacije je določil delež celic s Heinzovimi telesci med 250 eritrociti, kot opisuje študija na PMC, ki poroča o tem postopku.

Dve razliki preprečujeta napačno razlago. Prvič, metilno vijolično in kristalno vijolično obarvata Heinzova telesca intenzivneje kot novo metilensko modrilo, kot navaja tematski pregled o Heinzovih telescih na ScienceDirect. Novo metilensko modrilo je priročna izbira, kadar se retikulociti in Heinzova telesca ocenjujejo skupaj, ni pa najmočnejše namensko barvilo za Heinzova telesca. Drugič, vključki HbH pri nosilstvu alfa talasemije po supravitalnem barvanju ustvarijo številne drobne pike po vsej celici, medtem ko je klasičnih Heinzovih telesc manj, so večja in pogosto povezana z membrano. Tretji vir zamenjave so usedline barvila: ležijo zunaj goriščne ravnine celic in se razlikujejo med vidnimi polji.

Briljantno krezilno modrilo v primerjavi z novim metilenskim modrilom

Obe barvili sta supravitalni barvili za retikulocite, vendar standardizacija daje prednost enemu od njiju. Metoda za retikulocite CLSI H44-A2, razvita skupaj z Mednarodnim svetom za standardizacijo v hematologiji in navedena na strani standarda CLSI H44, določa barvanje krvi z EDTA z novim metilenskim modrilom kot ročno primerjalno metodo. Klasični hematološki učni viri se glede videza strinjajo: novo metilensko modrilo daje intenzivnejše in bolj enakomerno obarvane nitke, medtem ko se barvanje z briljantnim krezilnim modrilom bolj razlikuje med serijami in vzorci.

Ta status je treba pojasniti. Smernica ICSH za vrednotenje analizatorjev sprejema ročno mikroskopijo z novim metilenskim modrilom kot referenčni primerjalni pristop, vendar jo označuje kot subjektivno in razmeroma nenatančno ter daje prednost referenčnim postopkom s pretočno citometrijo, kadar so na voljo. Primerjava 100 vzorcev iz leta 2022 je ugotovila manjši sistematični odklon glede na uporabljeni analizator pri briljantnem krezilnem modrilu kot pri novem metilenskem modrilu, kot poroča primerjava metod barvanja na PMC. Utemeljen povzetek za študente je naslednji: uporabite novo metilensko modrilo kot standardizirano ročno primerjalno metodo, vsako lokalno metodo z briljantnim krezilnim modrilom preverite glede na to metodo ali avtomatizirano metodo ter pri ročni mikroskopiji v vsakem primeru pričakujte večji raztros rezultatov. Starejša literatura o standardizaciji je zagovarjala tudi prečiščeni Azure B kot kemijsko čistejšo alternativo, ker so se komercialne serije barvil razlikovale, kot opisuje Marshallova študija o Azure B. To pojasnjuje, zakaj se kakovostni razred reagenta še vedno pojavlja v razpravah o metodah.

Izogibanje običajnim napakam

Štiri napake pojasnijo večino neuspelih preparatov. Naročilo običajnega metilenskega modrila namesto novega metilenskega modrila N povzroči šibko barvanje zaradi kemijske sestave, ne zaradi tehnike. Fiksacija ali kontrastno barvanje pred odčitavanjem odstrani supravitalni signal. Štetje oborine barvila kot zrnc zviša rezultat, kar preprečujeta pravilo dveh zrnc in filtrirano barvilo. Štetje premajhnega števila celic pri nizkem odstotku retikulocitov da številko, ki je videti natančna, vendar ima široke meje zaupanja. Vsaka napaka ima isti prepoznavni znak: mikroskopist krivi mikroskop za nekaj, kar je določil korak z reagentom.