Članek
Protimikrobne raziskave metilenskega modrila: bakterije, glive in aktivacija s svetlobo
Dva bralca ob izrazu protimikrobno delovanje metilenskega modrila pomislita na različni stvari. Prvi si predstavlja modro tekočino, ki ob stiku zastrupi mikrobe. Drugi si predstavlja postopek, pri katerem jih uničita barvilo in rdeča svetloba. Obe predstavi vsebujeta del resnice. Nobena ni celovita, prav njuno mešanje pa je razlog, da je večina spletnih trditev napačnih.
Ta pregled obravnava razliko med njima. Metilensko modrilo ima pri zadostni koncentraciji zmerno toksičnost v temi. Ob rdeči svetlobi postane fotosenzibilizator: absorbira foton, preide v reaktivno tripletno stanje in sproži oksidativne kemijske reakcije, ki hkrati poškodujejo številne tarče. Ta način delovanja, aktiviran s svetlobo, ima svoje ime, protimikrobna fotodinamična terapija, in svoje pogoje. Ne določa ga zgolj koncentracija. O izidu odločajo valovna dolžina, odmerek svetlobe, inkubacija, kisik in organizem.
Dva načina uničevanja
Najprej si oglejmo delovanje v temi. Metilensko modrilo je pozitivno nabito fenotiazinijevo barvilo. Povezuje se z ovojnicami mikrobov, v različni meri vstopa v celice ter sodeluje v redoks reakcijah in kemijskih procesih vezave. Fotoni pri tem ne sodelujejo. Uničevanje se dogaja, vendar le pri koncentracijah, ki se med organizmi močno razlikujejo, mehanizem pa ni usmerjen v eno samo jasno določeno tarčo.
Fotodinamični način doda svetlobo. Rdeči fotoni pri približno 630 do 680 nm se prekrivajo z absorpcijskim pasom barvila, pri čemer je vrh monomera blizu 664 nm. Absorpcija prenese barvilo v kratkoživo singletno stanje, nato pa v dolgoživejše tripletno stanje. Od tam potekata dve skupini reakcij. Pri kemijskih reakcijah tipa I triplet prenese elektron na substrat in sproži radikalske poti, ki vključujejo superoksidne in hidroksilne zvrsti. Pri reakcijah tipa II prenese energijo neposredno na kisik v osnovnem stanju in tvori singletni kisik. Obe poti lahko potekata hkrati, zato je označevanje barvila kot izključno sredstva za tvorbo singletnega kisika preveč poenostavljeno. Pregled povezave med strukturo in aktivnostjo fenotiazinijevih fotosenzibilizatorjev to neposredno ponazarja: pri sorodnih barvilih bakterijska fototoksičnost ni sledila zgolj izkoristku tvorbe singletnega kisika, saj so bili privzem, lokalizacija in redukcija v neaktivno levko obliko enako pomembni kot fotofizika. Fotokemija, na kateri temelji pravilo glede valovne dolžine, je pojasnjena v spremljevalnem pregledu barvila in rdeče svetlobe.
Singletni kisik je ključen za eno koristno lastnost. Hkrati reagira s številnimi biomolekulami, zato napad vključuje več dejavnikov in ni usmerjen v en sam encim ali vezavni protein. Temeljni opis fotodinamične protimikrobne kemoterapije je to predstavil kot razlog, zakaj imajo običajni profili odpornosti majhno težo: dodatni protein, ki veže penicilin, ali mutirana topoizomeraza ne preprečita izbruha reaktivnih kisikovih zvrsti. Ta logika se je potrdila pri preskušanju proti na meticilin odpornemu Staphylococcus aureus in na vankomicin odpornim enterokokom, kot kaže spodnja preglednica. To ne pomeni, da odpornost ni mogoča, temveč le, da deluje drugače. Iztokovne črpalke in antioksidativni obrambni mehanizmi lahko še vedno spremenijo potreben odmerek, zlasti pri glivah.
Preglednica organizmov in raziskovalnih modelov
Ta preglednica je osrednji del članka. Vsaka vrednost velja za določen protokol: isto barvilo, drugačen odmerek svetlobe ali inkubacija, drugačna številka. MBC, MLC in MIC ne obravnavajte kot zamenljivih vrednosti. MBC in MLC tukaj pomenita, da pri subkultivaciji ni preživelih, MIC pa pomeni zaviranje rasti. Svetlobni pogoji so navedeni pri vsakem vnosu.
| Organizem in model | Rezultat v temi | Rezultat ob svetlobi | Pogoji |
|---|---|---|---|
| S. aureus NCTC 6571, planktonska suspenzija | MBC 5 uM | MBC 5 uM | Pregledna tabela, bela svetloba 12 J per cm2 |
| S. aureus NCTC 6571, planktonska suspenzija | MLC 2.5 uM | MLC 1 uM | Izvirni protokol iz leta 1997, 1.7 mW per cm2 za 1 uro, približno 6.3 J per cm2, inokulum blizu 10^6 CFU per mL, navedeno v izvirni raziskavi fotobaktericidnega delovanja fenotiazinijevih barvil |
| MRSA EMRSA-15, planktonska oblika | MBC 80 uM | MBC 20 uM | Pregledna tabela, približno 12 J per cm2, štirikratno povečanje občutljivosti |
| MRSA EMRSA-16, planktonska oblika | MBC 40 uM | MBC 10 uM | Isti protokol kot zgoraj |
| E. coli NCTC 9001, planktonska oblika | MBC 500 uM | MBC 100 uM | Isti protokol, petkratno povečanje občutljivosti |
| P. aeruginosa NCTC 10622, planktonska oblika | MBC 500 uM | MBC 25 uM | Isti protokol, dvajsetkratno povečanje občutljivosti |
| E. faecalis NCTC 775, planktonska oblika | MLC 100 uM | MLC 100 uM | Protokol iz leta 1997 pri 6.3 J per cm2, brez izboljšanja za ta sev in odmerek |
| Na vankomicin odporni E. faecium, planktonska oblika | MBC 400 uM | MBC 400 uM | Pregledna tabela, brez izboljšanja z osnovnim barvilom, medtem ko so bolj hidrofobni metilirani derivati prinesli izboljšanje, po raziskavi na vankomicin odpornega enterokoka |
| Candida albicans, planktonska oblika | MIC nad 12.79 ug per mL | MIC 12.79, 6.39 in 1.59 ug per mL pri 5, 10 in 15 J per cm2 | 30-minutna predinkubacija v temi, rdeča LED 600 do 650 nm z vrhom pri 635 nm, po raziskavi odvisnosti protiglivičnega fotodinamičnega delovanja metilenskega modrila od odmerka |
| C. albicans YEM14 v primerjavi s sevom s čezmernim izražanjem iztokovnih črpalk, uničevanje, merjeno s CFU | Ni relevantno | Približno 5 log uničevanja izhodiščnega seva, skoraj nič uničevanja seva s čezmernim izražanjem CDR1/CDR2 | 100 uM barvila, 30-minutna inkubacija, 660 nm pri 60 J per cm2, po raziskavi vplivov iztokovnih črpalk na fotouničevanje z metilenskim modrilom |
| Hife Trichophyton rubrum v primerjavi s sporami | Ni relevantno | MIC za hife približno 6.3 ug per mL, za spore približno 2.0 ug per mL; popolna preprečitev nastanka CFU je zahtevala 5 ug per mL in 100 J per cm2 za hife v primerjavi z 1.25 ug per mL in 40 J per cm2 za spore | Fotodinamični protokol pri 635 nm, po raziskavi občutljivosti razvojnih stadijev dermatofitov |
| Zrel subgingivalni biofilm s 33 vrstami, naprava Calgary, dan 6 | Sam MB zmanjša skupno število za več kot 80 odstotkov | MB z LED pri 660 nm zmanjša presnovno aktivnost za približno 55 odstotkov, brez obsežnega prestrukturiranja združbe | 0.01 odstotka barvila (100 ug per mL), 660 nm pri približno 330 mW per cm2 za 5 minut, anaerobna rast, po raziskavi večvrstnega ustnega biofilma in vitro |
Izstopajo trije vzorci. Prvič, grampozitivni stafilokoki odmrejo pri nizkih mikromolarnih koncentracijah, medtem ko gramnegativne paličaste bakterije v temi potrebujejo približno stokrat več barvila, ker njihova zunanja membrana omejuje vstop. Svetloba razliko zmanjša, vendar je ne odpravi. Drugič, protiglivično delovanje metilenskega modrila je resnično, vendar pogojeno: uničevanje gliv Candida z metilenskim modrilom se močno povečuje z odmerkom svetlobe, ena sama fenotipska sprememba, kot je čezmerno izražanje iztokovnih črpalk, pa lahko pri enakem odmerku izniči uničevanje v obsegu 5 log. Tretjič, zrel biofilm se vede drugače kot suspenzije; v ta okvir sodi vrstica z ustnim biofilmom.
Bakterije: kje svetloba najbolj pomaga in kje ne
Stafilokoki so primer občutljivih organizmov. Celo vrednosti za epidemične seve MRSA v pregledni tabeli so ob uporabi svetlobe enake ali nižje od primerjalnih vrednosti za vankomicin, dimetilirani derivati pa so se odrezali še bolje, ker je metilacija povečala lipofilnost in izkoristek tvorbe singletnega kisika ter zmanjšala dovzetnost za redukcijo v levko obliko. Ta kemijska podrobnost je pomembna: kaže, da je uničevanje rezultat dostave in fotofizike, ne zgolj fotofizike.
Gramnegativni organizmi ponazarjajo pomen dostave. Pseudomonas je potreboval 500 uM v temi in 25 uM ob svetlobi, kar je dvajsetkratno izboljšanje, vendar je vrednost ob osvetlitvi še vedno precej nad območjem za stafilokoke. Kationski naboj pomaga barvilu, da se približa zunanji membrani, vendar prodiranje ostaja omejitev. Formulacije, čas inkubacije in izbira derivata te številke spreminjajo bolj kot ponovna uporaba istega barvila v večjem odmerku.
Enterokoki opozarjajo na potrebo po previdnosti. Pri starejših protokolih E. faecalis ni pokazal nobene prednosti svetlobe, na vankomicin odporni E. faecium pa je potreboval drugo molekulo in ne več svetlobe. Kdor navaja eno samo vrednost MBC metilenskega modrila kot splošno protibakterijsko konstanto, literaturo razume napačno. Takšne konstante ni. Obstajajo le vrednosti, specifične za sev, gojišče, inokulum, inkubacijo, valovno dolžino in fluenco. Kako te vrednosti brati, ne da bi se zavajali, obravnava vodnik za razlago krivulj uničevanja.
Glive: občutljive, vendar odločajo razvojni stadij in črpalke
Glivne stene iz glukanov, mananov in hitina predstavljajo drugačen problem privzema kot pri bakterijah, glive pa imajo tudi aktivne obrambne mehanizme. Zgornji rezultat z iztokovnimi črpalkami pri Candida je najbolj izrazit primer: isto barvilo, ista svetloba, isto gojišče, pa vendar je sev s čezmernim izražanjem preživel, medtem ko je izhodiščni sev izgubil približno 99.999 odstotka enot, ki tvorijo kolonije. Dermatofiti dodajo še razvojno razsežnost. Spore odmrejo precej lažje kot hife, zato lahko protokol, ki odstrani spore, pri istem odmerku še vedno pusti žive fragmente hif.
Zato poročila o protiglivičnem delovanju metilenskega modrila zahtevajo enako doslednost pri svetlobnih pogojih kot bakterijska. Klinične fotodinamične raziskave nohtov in kože so uporabljale 1 do 2 odstotka barvila skupaj z izmerjeno rdečo svetlobo pri opredeljenih fluencah in spremljanjem ter ločevale klinični videz od mikološke ozdravitve. Ta preskušanja so pregledana v povzetku dokazov o fotodinamičnem delovanju pri glivičnih obolenjih nohtov in kože. Nanašanje razredčenega barvila na lezijo pri sobni svetlobi poustvari barvo, ne pa postopka.
Preverjanje na biofilmu: ustni model s 33 vrstami
Raziskava večvrstnega ustnega biofilma iz leta 2024 si zasluži pozornost, ker preskuša zahteven in ne lahek primer. Triintrideset ustnih vrst, vključno s Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium in ustnimi streptokoki, je anaerobno raslo v zrel biofilm do dneva 6. Obravnava je obsegala 0.01 odstotka barvila in LED pri 660 nm za 5 minut pri visoki obsevalni moči na površino. Tako samo barvilo kot sama svetloba sta občutno zmanjšala skupno število mikroorganizmov, kombinacija pa je zmanjšala presnovno aktivnost za približno polovico, vendar se združba ni prestrukturirala in biofilm ni bil steriliziran.
To je resničen učinek z jasno priznano omejitvijo. Podpira fotodinamično obravnavo kot lokalno dopolnilo v očiščenem žepu, ne pa kot izpiranje, ki bi samo zdravilo diagnosticirani parodontitis. S tem pridemo do splošnega razkoraka.
Zakaj laboratorijsko uničevanje ni enako zdravljenju
Pri določanju MBC v planktonski kulturi so enotne celice izpostavljene enakomerno porazdeljenemu barvilu in svetlobi v gojišču s kisikom. Lezija ne zagotavlja ničesar od tega. Matriks upočasnjuje vstop, stanja, podobna stanjem vztrajajočih celic, dopuščajo prenašanje oksidacije, kri in eksudat absorbirata svetlobo, geometrija tkiva ustvarja sence, hipoksični žepi pa oslabijo kemijske reakcije tipa II, saj singletni kisik po definiciji potrebuje molekularni kisik. Mešane okužbe vključujejo vrste, ki se razlikujejo po privzemu in občutljivosti, zato vrednost za en referenčni sev ne more predstavljati celotnega mesta okužbe.
Ustni primer ta razkorak ponazori konkretno. Zmanjšanje števila Porphyromonas ali streptokokov na plošči oziroma zmanjšanje gojenega biofilma za polovico ne dokazuje, da modra raztopina za izpiranje zdravi parodontitis, ozdravi endodontsko okužbo ali odpravi bakteriemijo. Klinična parodontalna oskrba temelji na mehanskem razgrajevanju in odstranjevanju biofilma ter obravnavi anatomije žepa, medtem ko se zdravljenje s svetlobo raziskuje kot lokalizirano dopolnilo. Koncentracija barvila, ki uničuje v vdolbinici laboratorijske plošče, nima stalne povezave s koncentracijo, ki doseže bakterije pod robom dlesni, sobna svetloba pa ni odmerek svetlobe pri 660 nm. Odmerjanje, varnost in omejitve glede interakcij pri kakršni koli oralni uporabi sodijo v pristojnost kliničnega strokovnjaka, kot je opisano v referenčnem pregledu varnosti in interakcij.
Česa ti dokazi ne pomenijo
Ne pomenijo trditve o gospodinjskem razkužilu. Baktericidne preglednice uporabljajo opredeljene seve, gojišča, kontaktne čase, spektre in fluence. Ničesar ne povedo o kuhinjskih površinah, potrebnih kontaktnih časih ob organski umazaniji ali regulativnih standardih za razkuževanje.
Prav tako ne pomenijo nadomestila za sistemske antibiotike. Običajno fotodinamično delovanje zahteva barvilo, absorbirano svetlobo in kisik na istem mestu ob istem času. Svetloba ne doseže globokih ali razsejanih mest okužbe tako, kot zaužito zdravilo doseže kri. Literatura ta pristop umešča v obravnavo dostopnih lokalnih okužb ali kot dopolnilo, natanko tako, kot je Wainwright že od začetka opredelil lokalno razkuževanje.
Pošten povzetek je ožji, a še vedno zanimiv. Metilensko modrilo ima zmerno protimikrobno aktivnost v temi, rdeča svetloba pa pri številnih bakterijah in glivah omogoči precej večji fotodinamični učinek, z velikimi razlikami med svetlobo in temo, kot sta 500 do 25 uM za Pseudomonas in 80 do 20 uM za epidemične seve MRSA, ob poučnih neuspehih pri enterokokih in Candida z učinkovitim iztokovnim sistemom. Prenos v prakso je odvisen od dostave, fiziologije biofilma in kisika prav toliko kot od nominalne koncentracije barvila. Če te pogoje ohranimo v ospredju, številke nekaj pomenijo. Če jih odstranimo, ne pomenijo ničesar.