Metilensko modrilo, Nrf2 in mitohondrijska biogeneza: razlaga

V besedilih o metilenskem modrilu se pogosto pojavlja en stavek: aktivira Nrf2 in ustvarja nove mitohondrije. Stavek zveni kot ena trditev, vendar vsebuje dva različna pojma, raziskana v različnih sistemih in z različnimi vrstami dokazov. Prvi je signalna pot, senzor, ki vklopi obrambne gene. Drugi je program gradnje, pri katerem celica ustvarja več mitohondrijskega aparata. Signal lahko sproži gradnjo, vendar dokaz, da se je signal sprožil, ni isto kot dokaz, da je bila stavba zgrajena, več gradbenega materiala pa še ne dokazuje boljše oskrbe z energijo. Ta članek te tri stvari obravnava ločeno.

Pojem Nrf2: senzor, ne ščit

Nrf2 (jedrni faktor, povezan z eritroidnim faktorjem 2) je transkripcijski faktor, beljakovina, katere naloga je vklapljanje genov. V mirovanju ga v citoplazmi zadržuje senzorska beljakovina Keap1, ki ga predaja celičnemu aparatu za odstranjevanje, tako da se neprestano razgrajuje. Ko oksidanti ali elektrofili spremenijo reaktivne cisteine na Keap1, se odstranjevanje ustavi. Novonastali Nrf2 se kopiči, preide v jedro, se poveže z majhnimi beljakovinami Maf in se veže na zaporedja DNA, imenovana elementi antioksidativnega odziva. Ta vezava vklopi cel niz obrambnih genov.

Klasični merljivi kazalniki te poti so specifični. NQO1 (NAD(P)H kinon dehidrogenaza 1) in TrxR1 (tioredoksin reduktaza 1) sodita med najzanesljivejše tarčne gene Nrf2. HO-1 (hem oksigenaza-1) je močno inducibilna, vendar se odziva tudi na druge regulatorje. Encimi, kot sta SOD in katalaza, so del antioksidativnega aparata, vendar njihove ravni nadzorujejo številni transkripcijski faktorji, zato povečanje SOD samo po sebi ne dokazuje, da je bil vzrok Nrf2. Dokazi, ki so najbližje samemu signalnemu dogodku, so kopičenje Nrf2 v jedru, aktivacija poročevalskega sistema ARE ali indukcija klasičnih tarč, ki izgine po odstranitvi Nrf2. Vse drugo — nižje ravni oksidantov, boljše preživetje v stresnih razmerah, več glutationa — so učinki v nadaljnjih korakih, ki jih lahko povzročijo številne poti.

Najzgodnejši rezultat z metilenskim modrilom v tej zgodbi sodi bližje neposrednim kazalnikom na tej lestvici. Fibroblasti, izpostavljeni nanomolarnim koncentracijam metilenskega modrila, so pokazali odloženo senescenco ob večji vsebnosti kompleksa IV, večji porabi kisika ter indukciji encimov faze 2, TrxR1 in NQO1, kot poroča študija, ki je metilensko modrilo prvič povezala z izboljšanjem mitohondrijskega delovanja in odložitvijo senescence. TrxR1 in NQO1 sta prav tisti klasični tarči Nrf2, ki ju želi videti pozoren bralec. Študija pa ni pokazala samega signalnega dogodka: ni bilo meritve Nrf2 v jedru, poročevalskega sistema ARE ali kontrole z izbitim genom Nrf2. Zato je poštena razlaga, da metilensko modrilo v tem sistemu inducira znane tarčne gene Nrf2, kar je skladno z aktivacijo Nrf2, vendar ne opredeli Nrf2 kot vzroka. Indukcija tarčnega gena je en korak za stikalom.

Pojem biogeneze: program s tremi kontrolnimi točkami

Mitohondrijska biogeneza je program, s katerim celica poveča svojo mitohondrijsko zmogljivost. Njena učbeniška hierarhija poteka skozi tri kontrolne točke. Prvič, koaktivator PGC-1alpha vklopi program. Drugič, jedrni transkripcijski faktorji (eden se nekoliko zavajajoče imenuje NRF1, jedrni respiratorni faktor 1, in je druga beljakovina kot Nrf2) spodbujajo izražanje mitohondrijskih genov, vključno s TFAM, ki vzdržuje in podvaja mitohondrijsko DNA. Tretjič, celica ima na koncu več mitohondrijskih genomov in več respiratornega aparata, kar lahko izmerimo kot število kopij mtDNA, aktivnost citrat sintaze ali količino in aktivnost respiratornih kompleksov.

Vsaka kontrolna točka podpira trditev drugačne moči kot prejšnja. Več informacijske RNA za PGC-1alpha ali TFAM kaže, da je bila podana zahteva po zagonu programa, ne pa, da je bil ta dokončan. Več mtDNA ali več beljakovin kompleksa IV kaže na več materiala, vendar je lahko enaka slika tudi posledica preoblikovanja mitohondrijev. Boljša respiracija, večja poraba kisika ali aktivnost kompleksov kažejo na spremembo delovanja, vendar se delovanje lahko izboljša, ne da bi nastal en sam nov mitohondrij. Trdna trditev o biogenezi združuje vse troje: regulator, vsebnost in delovanje.

Nadaljnja študija na fibroblastih je sledila večini te verige. V človeških celicah IMR90, obravnavanih s 100 nanomolarnim metilenskim modrilom, se je razmerje NAD proti NADH prehodno povečalo v 15 minutah in se v enem dnevu vrnilo na izhodiščno raven. Temu prehodnemu energijskemu signalu je sledila prehodna fosforilacija energijskega senzorja AMPK, nato pa indukcija PGC-1alpha in SURF1, beljakovine, potrebne za sestavljanje delujočega kompleksa IV. Aktivnost kompleksa IV se je približno podvojila, količina celičnih oksidantov se je zmanjšala za približno 28 odstotkov, telomeri pa so se krajšali počasneje. Celotno zaporedje je predstavljeno v članku, ki povezuje redoks aktivnost metilenskega modrila z AMPK in mitohondrijsko biogenezo.

Dve podrobnosti v tem članku si zaslužita pozornost, ker gre za vrsto podrobnosti, ki jih povzetki običajno izpustijo. Prvič, vzorec aktivacije je bil pomembnejši od same prisotnosti: metilensko modrilo je AMPK vklopilo prehodno, primerjalna učinkovina AICAR pa trajno, pri čemer je prehodni aktivator senescenco odložil približno osemkrat učinkoviteje. Trditev v obliki »metilensko modrilo aktivira AMPK« je zato nepopolna; bistveno je, da AMPK aktivira prehodno, primerjava pa nakazuje, da trajna aktivacija ne doseže enakega učinka. Drugič, metilensko modrilo ni spremenilo celičnega cikla, kar izključuje najpreprostejšo alternativno razlago: da so se celice zgolj počasneje delile in zato delovale mlajše.

Veja raziskav na miših: vedenje, genomi in namerno paradoksen sprožilec

Delo na celičnih kulturah je na živali razširila skupina, ki je preučevala miši srednje starosti. Po 60 dneh peroralnega dajanja metilenskega modrila so obravnavane miši ohranile več telesne vzdržljivosti in raziskovalnega vedenja ter pokazale manj vedenja, podobnega tesnobi, kot neobravnavane ostarele miši. V možganskem tkivu se je izražanje genov, ki ga je staranje zmanjšalo — NRF1, TFAM, SOD2 in podenote kompleksa IV COX1 — ponovno približalo ravnem pri odraslih živalih, število kopij mtDNA pa se je povečalo. O teh rezultatih, ki združujejo vedenje, regulator in količino genomov, poroča študija na miših srednje starosti o metilenskem modrilu in mitohondrijski biogenezi v možganih.

Predlagani sprožilec je zanimiv, ker nasprotuje preprosti razlagi, da je metilensko modrilo antioksidant. Pri obravnavanih miših je bilo nastajanje reaktivnih kisikovih zvrsti v možganskih mitohondrijih večje, zlasti nastajanje vodikovega peroksida. Avtorji so predlagali naslednjo razlago: blag peroksidni signal aktivira pot Nrf2, ta pa nato sproži program biogeneze. V tem modelu je metilensko modrilo v sprožilnem koraku prooksidant, pri končnem izidu pa antioksidant. Farmakologi tak vzorec imenujejo hormeza: majhen stres izzove obrambo, ki je močnejša od samega stresa. Ali porast peroksida dejansko povzroči aktivacijo Nrf2, ni bilo neposredno preverjeno; gre za predlagano povezavo, ne za izmerjeno.

Spremljevalna študija iste skupine je varnostni vidik te razlage preverila v zahtevnejših razmerah. V izoliranih možganskih mitohondrijih je metilensko modrilo povečalo nastajanje vodikovega peroksida že pri koncentracijah 50 nanomolar, vendar terapevtske koncentracije niso povzročile zaznavnih poškodb mitohondrijske DNA. Šele pri 100 mikromolar, kar je daleč nad terapevtskimi ravnmi, so izbrani fragmenti mtDNA pokazali poškodbe. Kombinacija barvila v koncentraciji 20 mikromolar z rdečo svetlobo pa je ustvarila singletni kisik, ki je poškodoval mtDNA v širšem obsegu. To je znano delovanje barvila kot fotosenzibilizatorja, ne pa njegovo farmakološko delovanje brez svetlobe. Predhodna obravnava je mitohondrije ventralnega dela srednjih možganov celo zaščitila pred poškodbami mtDNA, ki jih povzroča rotenon. Odziv v odvisnosti od odmerka in kontrole genotoksičnosti so podrobno opisani v študiji o negenotoksičnem nastajanju peroksida zaradi metilenskega modrila.

Izmerjeno in predlagano: branje diagrama

Spodnji diagram poti je bil pripravljen za ta članek, da jasno uveljavi razlikovanje, ki ga poudarja besedilo. Okvirji s polnimi robovi prikazujejo korake z neposredno eksperimentalno podporo v literaturi o metilenskem modrilu: redoks kroženje, ki spremeni razmerje NAD/NADH, prehodno fosforilacijo AMPK, indukcijo PGC-1alpha in SURF1, večjo aktivnost kompleksa IV, indukcijo NQO1 in TrxR1, ponovno povečano izražanje genov biogeneze in število kopij mtDNA v mišjih možganih ter povišanje peroksida brez poškodb mtDNA pri terapevtskih odmerkih. Okvirji s črtkanimi robovi prikazujejo predlagane povezave: zaznavanje peroksidnega signala s Keap1, kopičenje Nrf2 v jedru, ki spodbuja obrambne gene, in vzročno puščico od aktivacije Nrf2 do programa biogeneze. Ti črtkani koraki so verjetni, skladni s podatki in standardno učbeniško biologijo, vendar v teh člankih niso bili izmerjeni s kontrolami (Nrf2 v jedru, poročevalski sistemi ARE, izbitje gena Nrf2), ki bi upravičile njihov prikaz s polnimi okvirji.

Ko imate diagram pred seboj, postanejo očitne tri možne zamenjave. Prvič, NRF1 in Nrf2 sta različni beljakovini s skoraj enakima imenoma; študija na miših je merila jedrni respiratorni faktor 1, regulator biogeneze, ne antioksidativnega transkripcijskega faktorja. Če ju enačimo, celoten diagram skrčimo na eno vozlišče. Drugič, izražanje genov je začetek zgodbe, ne njen konec; ponovno povečane ravni informacijske RNA za TFAM ali COX1 podpirajo zahtevo po biogenezi, medtem ko sta število kopij mtDNA in aktivnost kompleksa IV dokaza, da je bila zahteva izpolnjena. Tretjič, antioksidativni izid ne dokazuje poti prek Nrf2; 28-odstotno zmanjšanje oksidantov v fibroblastih in zaščita pred rotenonom pri miših sta resnična učinka v nadaljnjih korakih, vendar do njiju vodi več poti.

Kaj bi črtkani okvir spremenilo v polnega

Manjkajoči poskusi so standardni. Merjenje beljakovine Nrf2 v jedru po izpostavitvi metilenskemu modrilu, s časovnim potekom, usklajenim s prehodnim signalom AMPK, bi preverilo, ali se obe veji dejansko sprožita skupaj, kot trdi hipoteza sinhronizirane aktivacije. Poročevalski sistem pod nadzorom ARE bi potrdil transkripcijsko aktivnost, namesto da bi o njej sklepali iz tarčnih genov. Ponovitev meritev kazalnikov biogeneze ob utišanem ali izbitem genu Nrf2 bi neposredno preverila vzročno povezavo: če se indukcija kompleksa IV in povečanje mtDNA ohranita brez Nrf2, je povezava napačna in učinek zagotavlja samo veja AMPK. Pri živalih bi študija dolgotrajnega dajanja z istimi tremi kontrolnimi točkami — regulatorjem, vsebnostjo in delovanjem — preverila, ali program ostane vklopljen ali se prilagodi. Do takrat sinhronizirana aktivacija energijskih in obrambnih poti ostaja to, kar so jo imenovali njeni avtorji: možen ključni dejavnik, ne dokazan mehanizem.

Bralce, ki izhajajo iz širše farmakologije, bo morda zanimal tudi širši kontekst: kako metilensko modrilo prenaša elektrone na mitohondrijski ravni, kaj še počne z mitohondriji in celično energijo, kam se ugotovitve o senescenci umeščajo v raziskave staranja, kako se trditve o biogenezi povezujejo s kognitivno zmogljivostjo in kateri podatki o varnosti postavljajo meje vsaki razpravi o odmerjanju. Vsako od teh vprašanj je ločen pojem z lastnimi dokazi in pri vsakem si razlikovanje med izmerjenim in predlaganim zasluži enako pozornost, kot jo je ta članek namenil Nrf2.