Metilensko modrilo in nevrotransmiterji: serotonin, dopamin, GABA in acetilholin

Pogosta trditev o metilenskem modrilu pravi, da hkrati zvišuje serotonin, zvišuje dopamin, pomirja GABA in izostri delovanje acetilholina. Ta trditev obravnava štiri ločene laboratorijske ugotovitve kot en sam učinek v človeku. Raziskave, na katerih temelji, so merile različne tarče v različnih preparatih pri koncentracijah, ki se razlikujejo za približno tisočkrat. Ko tarče ločimo, postane slika zanimivejša in zahteva več previdnosti, kot jo dopušča ta en sam stavek.

Izhodiščna zamisel je preprosta. Molekula, ki se veže na encim v epruveti, je naredila eno stvar: vezala se je na encim v epruveti. Ali to spremeni raven nevrotransmiterja v živih možganih, je odvisno od koncentracije, ki doseže tkivo, od kemijske oblike molekule ob prihodu in od vsega drugega, kar molekula počne pri isti koncentraciji. V vsakem spodnjem razdelku ostajajo ta tri vprašanja povezana z ugotovitvijo, na katero se nanašajo.

Serotonin: dve tarči, dve koncentraciji

Med štirimi sistemi so dokazi najmočnejši za serotonin, izhajajo pa iz dveh različnih molekularnih tarč, ki ju ne smemo združevati.

Prva tarča je monoaminooksidaza tipa A, mitohondrijski encim, ki razgrajuje serotonin. Metilensko modrilo zavira prečiščeno človeško MAO-A kot tesno vezavni zaviralec s Ki okoli 27 nanomolarov, medtem ko so za vpliv na MAO-B potrebne precej višje koncentracije, kot je pokazala kinetična študija, ki je barvilo povezala s serotoninsko toksičnostjo. Sorodna raziskovalna smer je enako selektivnost ugotovila v tkivu češarike podgan, kjer je blokada MAO-A povečala količino indolov, ki izvirajo iz serotonina, zmanjšala količino serotoninskega presnovka 5-HIAA in spremenila s serotoninom povezan obračalni refleks pri žabah, kot poroča študija redoks barvil in indolov v češariki. Dva različna preparata, ista smer: manj razgradnje in več ohranjenega serotonina tam, kjer bi ga encim sicer odstranil.

Druga tarča je sam serotoninski prenašalec. V celicah, ki izražajo človeški prenašalec, je metilensko modrilo zmanjšalo privzem tako fluorescentnega substrata kot označenega serotonina z IC50 okoli 1.4 mikromolara ter zavrlo tokove, izzvane s serotoninom, pri meritvah z metodo vpete krpice, kot opisuje neposredna karakterizacija metilenskega modrila pri SERT. Avtorji so preverili očitne alternativne razlage in ugotovili, da je učinek neodvisen od signalizacije prek cGMP, sprememb kalcija in izražanja prenašalca na celični površini.

Bodite pozorni na razliko med obema številkama. Zaviranje MAO-A se dogaja v nanomolarnem območju. Zaviranje prenašalca zahteva približno petdesetkrat več barvila. Nizka izpostavljenost, ki v celoti vpliva na encim, lahko na prenašalec vpliva komaj opazno. Kdor to združi v eno samo trditev o serotoninu, dve različni območji odmerkov povpreči v eno.

Ali je katera od teh tarč pomembna pri osebi, ki jemlje druga serotonergična zdravila, je vprašanje zdravil in sodi v vodnik o medsebojnem delovanju zdravil. Ta članek prikazuje tarče; klinični nasveti so na tisti strani.

Dopamin: najšibkejši neposredni dokazi

Pri dopaminu poštenost zahteva največ zadržanosti. Ni dobro uveljavljene študije, ki bi pokazala, da metilensko modrilo blokira dopaminski prenašalec ali se neposredno veže na dopaminske receptorje. Pogosto navajani IC50 prenašalca, 1.4 mikromolara, velja za serotoninski prenašalec, ne za DAT, in ga nikoli ne smemo pripisati drugemu prenašalcu.

Obstoječi dokazi so namesto tega posredni. Ker encimi MAO presnavljajo tudi dopamin, zaviranje MAO poleg serotonina in noradrenalina ohranja tudi dopamin. V mitohondrijskih preparatih je metilensko modrilo blokiralo pretvorbo nevrotoksina MPTP v njegovo dopaminergično toksično obliko, ki jo posreduje MAO-B, z močjo delovanja, primerljivo z deprenilom, zdravilom za Parkinsonovo bolezen, kot opisujejo študija bioaktivacije MPTP in sorodne raziskave MAO-B. Raziskave na živalih dodajajo delne ugotovitve: približno trikratno povečanje bazalnega sproščanja dopamina iz rezin striatuma podgan pri 10 mikromolarov, proučevano v okviru signalizacije z dušikovim oksidom in ne kot blokada prenašalca, ter neenotne rezultate med možganskimi regijami po sistemskem odmerjanju, pri čemer so nekatere študije ugotovile porast serotonina in noradrenalina, dopamin pa se je komaj spremenil.

Zgodba o dopaminu je torej resnična, vendar posredna. Poteka prek encima, ki hkrati presnavlja več monoaminov, ne prek tarče, specifične za dopamin. Vsaka trditev, da metilensko modrilo zvišuje dopamin pri ljudeh, preskoči korak, v katerem bi bilo to dejansko dokazano.

GABA: blokiranje zavore v vezavnem žepu

Ugotovitev glede GABA je natančna in nasprotuje slovesu barvila. V celicah, ki izražajo človeške receptorje GABA-A, je metilensko modrilo zaviralo tokove, izzvane z GABA, že pri približno 3 mikromolarov, z IC50 okoli 31 mikromolarov za običajno konfiguracijo alpha1-beta2-gamma2, kot je pokazala elektrofiziološka študija, ki je določila mesto delovanja.

Določitev mesta delovanja je dragoceni del ugotovitve. Mutacije na pikrotoksinskem mestu niso spremenile zaviranja, benzodiazepinsko in cinkovo mesto pa sta bili izključeni s primerjavami podenot. Nasprotno so mutacije na dveh aminokislinskih ostankih, za katera je znano, da tvorita sam vezavni žep za GABA, močno zmanjšale blokado. To opredeljuje delovanje kot kompetitivni antagonizem na agonističnem mestu in ne kot alosterično modulacijo drugje. Učinek se je ohranil pri sinaptičnih in zunajsinaptičnih kombinacijah podenot ter po izpiranju hitro izginil.

To ustvarja resnično nasprotje, ki ga je vredno jasno povedati. Molekula, ki jo raziskujejo za podporo spominu, obenem zavira hiter zaviralni prenos v laboratorijski posodici. Ali do tega zaviranja pride v živih možganih, je odvisno od lokalne koncentracije, 31 mikromolarov pa je visoka vrednost glede na večino sistemskih izpostavljenosti, kar obravnava zadnji razdelek. Samo nasprotje je ugotovitev; za njegovo razrešitev bi bili potrebni poskusi, ki jih še nihče ni izvedel.

Acetilholin: dve nasprotujoči si tarči

Pri acetilholinu imamo dve ugotovitvi, ki delujeta v nasprotnih smereh, in prav zato ju moramo predstaviti ločeno.

Na eni strani metilensko modrilo zavira encime, ki odstranjujejo acetilholin. Acetilholinesteraza iz govejih rdečih krvničk je bila kompetitivno zavrta pri približno 0.57 mikromolara, goveji encim pri okoli 0.42 mikromolara, esterazna aktivnost v človeški plazmi pa pri okoli 1.1 mikromolara. Butirilholinesteraza je bila zavrta v območju približno od 0.4 do 5.3 mikromolara, odvisno od vrste in preparata, kot povzema pregled delovanja metilenskega modrila v živčevju. Upočasnjeno odstranjevanje pusti več nevrotransmiterja v sinapsi, kar je ista logika, na kateri temelji več odobrenih zdravil za Alzheimerjevo bolezen.

Toda pri tem obstaja kemijski pogoj. Oksidirana modra oblika zavira encim; reducirana brezbarvna oblika ga ne. Dolge inkubacije, ki omogočijo redukcijo barvila, že zgolj zato pokažejo šibkejše zaviranje. Vsak izmerjeni podatek za holinesterazo spremlja nevidna spremenljivka: kolikšen delež barvila je bil ob meritvi še moder.

Na drugi strani metilensko modrilo blokira nikotinski receptor alpha7, enega od receptorjev, na katere deluje acetilholin. Človeški receptorji alpha7, izraženi v jajčnih celicah žab, so bili zavrti z IC50 okoli 3.4 mikromolara prek nekompetitivnega, od napetosti neodvisnega antagonizma, pri katerem se moč delovanja agonista ni spremenila, 3 mikromolari pa so odpravili s holinom izzvane sinaptične odzive v rezinah hipokampusa podgan, kot poroča študija receptorja alpha7. Pri podobnih nizkih mikromolarnih koncentracijah barvilo torej ohranja nevrotransmiter in hkrati zmanjšuje odzivnost enega od njegovih receptorjev. Skupnega učinka na holinergično signalizacijo ni mogoče razbrati iz nobene od teh ugotovitev same zase. Ta dvoumnost se navezuje na širšo literaturo o Alzheimerjevi bolezni in na povezano razpravo o raziskavah kognicije in bolezni, vendar je tu ne razrešimo.

Primerjava na enem mestu

Najobčutljivejšo tarčo od najmanj občutljive ločijo trije velikostni redi. Ta razpon povzema članek v eni tabeli.

Ali te koncentracije dosežejo možgane?

Številka iz epruvete ne pomeni ničesar brez podatka o izpostavljenosti ob njej. Po intravenskem bolusu okoli 1.4 mg na kg so poročali o povprečnih ravneh v človeški plazmi okoli 5 mikromolarov, medtem ko je peroralni odmerek 100 mg v istem sklopu literature povzročil ravni v polni krvi okoli 0.08 mikromolara. Raziskave porazdelitve pri podganah ugotavljajo ravni v možganih, ki so približno deset- do dvajsetkrat višje od ravni v obtoku, vendar gre pri tem za celotno barvilo v homogeniziranem tkivu, ne za prosto oksidirano barvilo v sinapsi. Vezava na plazemske beljakovine okoli 94 odstotkov skupaj s porazdeljevanjem v krvne celice dodatno zmanjšuje prosti delež.

Če to primerjamo s tabelo, je vzorec postopen in ne binaren. Zaviranje MAO-A se pojavlja daleč pod običajnimi intravenskimi izpostavljenostmi in je farmakološko verjetno, kadar se barvilo daje na ta način. Učinki na holinesterazo in alpha7 so v nizkem mikromolarnem območju, s katerim se intravenske najvišje koncentracije prekrivajo, običajni peroralni odmerki pa ga morda ne dosežejo. IC50 za GABA-A, 31 mikromolarov, je nad večino verjetnih sistemskih izpostavljenosti, zato je prav to blokado najtežje predpostaviti pri človeku kot celoti. Vsaka vrstica te primerjave zahteva isto opozorilo: pomembna je koncentracija prostega, oksidiranega, zunajceličnega barvila pri tarči, torej količina, ki je noben odvzem krvi ne meri neposredno.

Česa ne smemo sklepati

Nobena vrstica v tabeli ne dokazuje, da metilensko modrilo pri človeku predvidljivo zvišuje ali znižuje raven katerega koli nevrotransmiterja. Zaviranje encima v prečiščenem preparatu, blokada prenašalca v celični liniji in antagonizem receptorja v tkivni rezini so vsak zase nadzorovan korak, ločen od sinaptične resničnosti, razdelek o acetilholinu pa prikazuje dve resnični ugotovitvi, katerih nasprotujoča si učinka vodita v negotovost. Odgovorna uporaba te strani je, da jo razumemo kot zemljevid tarč, za katere je dokazano, da nanje molekula deluje, z označeno močjo delovanja, tako da razprava o mehanizmih ostane zasidrana v tem, kar je bilo dejansko izmerjeno. Za vprašanje, kako te tarče vplivajo na medsebojno delovanje s predpisanimi zdravili, je pristojen vodnik o medsebojnem delovanju, dodatni kontekst pa ponujajo osnove farmakologije in spremljevalna razlaga mehanizmov.