Zakaj se metilensko modrilo uporablja kot protibarvilo pri barvanju acidorezistentnih bakterij

Laboratorijski tehnik pregleda razmaz izmečka po celotnem postopku barvanja. Rdeče paličice izstopajo na modrem ozadju, izvid pa navaja, da so bili opaženi acidorezistentni bacili. Naslednji dan je na drugem preparatu vidno enakomerno modro polje brez rdečih paličic, rezultat pa je naveden kot negativen za tuberkulozo. Eden od teh izvidov trdi več, kot je mogoče sklepati iz preparata, in to ni prvi.

Zmeda izvira iz napačnega razumevanja. Tehnik je modro barvilo obravnaval kot del kemije zaznavanja, kot da bi metilensko modrilo pomagalo najti mikobakterije. Ni jih. Ko metilensko modrilo pride v stik s preparatom, je preizkus že končan. Barvilo le obarva ozadje, da je rezultat mogoče razbrati. Ta članek pojasnjuje namen metilenskega modrila pri barvanju acidorezistentnih bakterij, zakaj se uporablja modra in ne katera druga barva ter kaj lahko sklepamo iz rdečega na modrem ozadju.

Kratek odgovor

Barvanje acidorezistentnih bakterij je diferencialni preizkus, ki temelji na treh načelih. Karbolfuksin, primarno barvilo, s postopkom vnesemo v vse celice, tudi v mikobakterije z voskasto ovojnico. Kisli alkohol, sredstvo za razbarvanje, odstrani rdeče barvilo iz običajnih celic, iz acidorezistentnih pa ga ne more izločiti. Metilensko modrilo, protibarvilo, nato obarva vse, kar je sredstvo za razbarvanje razbarvalo, zato so neacidorezistentne celice, gostiteljske celice in drobir videti modri, acidorezistentni bacili pa ostanejo rdeči. Protibarvilo zagotavlja kontrast. Ne sodeluje pri kemijskih lastnostih, zaradi katerih je celica acidorezistentna.

Vloga posameznih korakov

Spodnja shema prikazuje razdelitev nalog. Od leve proti desni jo berite kot postopek, spodnji pas pa kot opomnik, da vsaka skupina metod barvanja odgovarja na drugo vprašanje.

Najprej je na vrsti prodiranje. Mikobakterije se upirajo običajnim vodnim barvilom, ker je njihova ovojnica izrazito hidrofobna, zato protokol omogoči prisilen vnos. Pri metodi po Ziehl-Neelsenu segrevanje do nastajanja pare omogoči karbolfuksinu, ki vsebuje fenol, prodor skozi voskasto steno. Pri hladni metodi po Kinyounu segrevanje nadomesti precej močnejša formulacija primarnega barvila, nekatere prilagojene različice brez segrevanja pa dodajajo površinsko aktivne snovi. Protokoli Ameriškega združenja za mikrobiologijo za barvanje acidorezistentnih bakterij obe formulaciji dokumentirajo drugo ob drugi, razlika v koncentraciji pa je izrazita: približno 0.3 g bazičnega fuksina na 100 mL pri metodi s segrevanjem v primerjavi s približno 4 g pri hladni metodi.

Drugi korak je razlikovanje. Kisli alkohol, običajno 3 mL koncentrirane klorovodikove kisline v 97 mL 95-odstotnega etanola, izpere rdeče barvilo iz vseh celic, katerih stena ne zagotavlja posebne odpornosti. Celice z nepoškodovano mikobakterijsko lipidno ovojnico barvilo zadržijo. To je odločilni korak celotne metode in korak, ki je najbolj občutljiv za izvedbo, kot je pojasnjeno spodaj.

Kontrast pride na koncu. Na preparatu so zdaj rdeče acidorezistentne celice na skoraj brezbarvnem ozadju razbarvanih celic. Metilensko modrilo v 0.3-odstotni koncentraciji w/v ozadje znova naredi vidno v barvi, ki se kar najbolj razlikuje od rdeče. Protibarvanje je kratko, običajno traja od 20 do 30 sekund pri metodi s segrevanjem in do nekaj minut pri nekaterih različicah hladne metode. Čas je odvisen od protokola, ne od lastnosti samega barvila.

Zakaj to barvilo in zakaj modra barva

Metilensko modrilo je kationsko bazično barvilo, kar pomeni, da ima njegov obarvani ion pozitiven naboj in se veže na negativno nabite površine razbarvanih bakterij, gostiteljskih celic in drobirja. OpenStax Microbiology to delovanje nabojev opisuje kot splošno načelo bazičnih barvil. Vendar metilensko modrilo tu ni kemijsko edinstveno. Tudi kristal vijolično in safranin sta bazični barvili. Izbira temelji na optiki, ne na kemiji.

Rdeče paličice potrebujejo ozadje kontrastnega odtenka, modra pa pri mikroskopiji v svetlem polju zagotavlja posebej uporabno nasprotje rdeči. Safranin bi bil slabo protibarvilo, ker je njegov končni rožnato-rdeči odtenek preblizu zadržanemu karbolfuksinu in bi zabrisal prav razliko, ki jo je postopek ustvaril. Kristal vijolično bi ustvarilo temno vijolično ozadje, ki bi tekmovalo s tankimi rdečimi bacili za pozornost. Najmočnejši dokaz, da gre za kontrast in ne za kemijo, je možnost zamenjave: v nekaterih veterinarskih in prilagojenih protokolih uporabljajo zelena protibarvila, kot sta malahitno zelenilo in briljantno zelenilo, preizkus pa še vedno deluje, saj vsak jasno drugačen odtenek opravi isto nalogo.

Iz tega sledita dve praktični posledici. Prvič, standardna receptura ne predpisuje prilagajanja pH; te navadne 0.3-odstotne vodne raztopine ne zamenjujte z alkalnimi formulacijami, kot je Loefflerjevo metilensko modrilo, ki sodijo v drugačen koncept barvanja. Drugič, pretiravanje škodi. Histološka literatura izrecno opozarja, da lahko preveč intenzivno modro ozadje zakrije maloštevilne bacile, zato daljša izpostavljenost barvilu, kot jo dovoljuje protokol, poslabša preglednost brez kakršne koli koristi.

Kemija celične stene, ki omogoča preizkus

Razlog, da kisli alkohol omogoča razlikovanje, je v mikobakterijski ovojnici. Njeno strukturno jedro je kompleks mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikan je povezan z arabinogalaktanom, katerega zunanji konci nosijo mikolne kisline z zelo dolgimi verigami. Te tvorijo z lipidi bogato zunanjo mikomembrano z izrazito nizko prepustnostjo. Pregledni članek o zunanji membrani mikobakterij podrobno opisuje to zgradbo. Pregrada deluje v obe smeri. Ovira vstop barvila, zato je za prodiranje potrebno segrevanje ali močnejše primarno barvilo, in ovira njegovo izločanje, zato kisli alkohol ne more odstraniti karbolfuksina, ko je ta že v notranjosti. Običajne bakterije te ovojnice nimajo in barvilo izgubijo. Acidorezistenco je zato najbolje razumeti kot pojav, ki temelji na lipidni pregradi, ne kot kemijsko vezavo fuksina na mikolno kislino.

Ta kemija pojasnjuje tudi pogosto uganko: mikobakterije se po Gramu barvajo slabo in nepredvidljivo, včasih pa so videti kot rahlo obarvane zrnate oblike ali neobarvani obrisi. Njihova hidrofobna stena omejuje prodiranje kristal vijoličnega. Barvanje acidorezistentnih bakterij ni prilagojeno barvanje po Gramu. Gre za drugačno načelo razlikovanja, ki temelji na drugi lastnosti celične stene, kot za preostali dve metodi prikazuje primerjava enostavnega barvanja in barvanja po Gramu.

Tri metode, tri vprašanja

Za širšo skupino metod barvanja bakterij z enim barvilom glejte atlas barvanja za mikroskopijo.

Česa rdeče na modrem ozadju ne more dokazati

Rdeče paličice pomenijo, da so organizmi ob izpostavitvi kislemu alkoholu zadržali karbolfuksin. Takšna ugotovitev je skladna z Mycobacterium tuberculosis, vendar smernice CDC za diagnostiko tuberkuloze izrecno opozarjajo, da so acidorezistentne tudi druge mikobakterije, zato sta za identifikacijo vrste potrebna gojenje in testiranje nukleinskih kislin, ne barva.

Napake pri izvedbi se najpogosteje pojavijo pri obeh izpiranjih. Nezadostno razbarvanje pusti material v ozadju rdeč in lahko povzroči lažno pozitivno odčitavanje. Pretirano razbarvanje odstrani šibko zadržano primarno barvilo in prispeva k lažno negativnim rezultatom. Preveč intenzivno protibarvanje zakrije maloštevilne bacile v modrini. Debeli razmazi, oborjeni reagenti in onesnažena voda za izpiranje dodajo svoje artefakte.

Občutljivost omejuje količina organizmov, ne glede na to, kako brezhibna je izvedba. Običajna mikroskopija razmaza zahteva približno 5,000 do 10,000 bacilov na mililiter izmečka, starejši pregledi dokazov CDC pa so občutljivost razmaza pri pljučnih primerih, potrjenih s kulturo, ocenili na približno 45 do 80 odstotkov. Negativen razmaz zato nikoli ne izključuje tuberkuloze. Trenutne smernice CDC poleg vsakega razmaza ohranjajo tudi kulturo in priporočajo test pomnoževanja nukleinskih kislin na vsaj enem vzorcu iz dihal, kadar obstaja sum na pljučno tuberkulozo in bi rezultat spremenil obravnavo.

Praktično delo mora slediti odobrenim protokolom

Izobraževalni opisi, vključno s tem člankom, ne dajejo pooblastila za klinično delo. Pri laboratorijskem delu sledite validiranemu standardnemu operativnemu postopku laboratorija, usklajenemu s trenutnimi dokumenti CDC, APHL ali CLSI; referenčni dokument CDC za barvanje acidorezistentnih bakterij v arhivu Stacks prikazuje, kako takšni postopki določajo reagente in odčitavanje rezultatov. Delo z vzorci za tuberkulozo zahteva ukrepe za zadrževanje bioloških nevarnosti: razmazi se pripravljajo v biološki varnostni komori, ker pri pripravi nastajajo aerosoli in brizgi. Smernice CDC za laboratorijsko varnost navajajo, da lahko tudi toplotno fiksirani razmazi vsebujejo žive bacile tuberkuloze in jih je zato treba še vedno obravnavati kot kontaminirane. Vnos v javnozdravstveni slikovni knjižnici CDC za razmaz, barvan s karbolfuksinom in metilenskim modrilom ter pregledan za M. leprae je koristen opomnik, da uporabnost metode sega dlje od tuberkuloze: enak kontrast rdečega na modrem se uporablja povsod, kjer iščemo acidorezistentne organizme, tudi skrbno ugotovljen negativen rezultat pa je vreden zapisa.

Odčitavanje končnega preparata

Protibarvilo svojo vlogo upraviči med pregledovanjem. Mikroskopist pri pregledovanju z majhno povečavo najprej uporabi modro ozadje za presojo kakovosti razmaza: enakomerna razporeditev celic, nepoškodovane gostiteljske celice za izostritev in odsotnost večje količine oborine. Morebitni rdeči bacili nato pritegnejo pogled prav zato, ker na preparatu nič drugega ni rdeče. Potrditev poteka z oljno imerzijo, pri kateri pravi bacili pokažejo pričakovano obliko tankih, včasih rahlo ukrivljenih ali zrnatih paličic, ne pa enoličnega drobirja barvila.

Obarvanost ozadja določa tudi izrazje v izvidu. Pri preparatu z rdečimi bacili izvid navaja, da so bili opaženi acidorezistentni bacili, pogosto s semikvantitativno oceno po lestvici laboratorija. Pri preparatu brez rdečih organizmov izvid navaja, da acidorezistentni bacili niso bili opaženi, nikoli pa, da je rezultat negativen za tuberkulozo. Razlika je pomembna, ker modro polje dokazuje, da je barvanje delovalo, da so celice sprejele protibarvilo in da so bile optične razmere ustrezne, ne pove pa ničesar o organizmih pod mejo zaznave. Prazno modro polje je veljaven rezultat o preparatu, ne sklep o bolniku.

Če si zapomnite razdelitev nalog, je oblikovanje izvida preprosto. Karbolfuksin razkrije morebitne bacile. Kisli alkohol izvede preizkus. Metilensko modrilo le omogoči, da je odgovor razviden: rdeče je kljub kislini zadržalo barvilo, modro pa ga je izgubilo. Vse drugo, vrsta, količina organizmov in klinični pomen, izhaja iz preiskav, ki presegajo sam preparat.