Metilensko modrilo in avtofagija: AMPK, mTOR in poskusi na nevronskih celicah

Predstavljajte si, da izvajate poskus s celicami, dodate metilensko modrilo in na imunoblotu opazite temnejši pas beljakovine LC3-II. Mamljivo je razglasiti, da spojina »spodbuja avtofagijo«, in nadaljevati. Takšna razlaga je preuranjena. Temnejši pas LC3-II lahko pomeni, da celica tvori več mešičkov za odstranjevanje odpadnih sestavin, lahko pa pomeni, da se mešički kopičijo, ker je korak odstranjevanja blokiran. Razlagi kažeta v nasprotni smeri, literatura o metilenskem modrilu v nevronskih modelih pa vsebuje primere obeh vrst dokazov. Ta članek po posameznih metodah preverja, kaj je bilo dejansko izmerjeno.

Makroavtofagija, oblika, ki jo obravnavamo tukaj, je način, kako celica reciklira večje količine svojih sestavin. Membranska vrečka, imenovana fagofor, raste okoli izrabljenih beljakovin in organelov, se zapre v avtofagosom, zlije z lizosomom, njena vsebina pa se razgradi in sprosti za ponovno uporabo. Nevroni so odvisni od tega procesa, ker se ne delijo in poškodovanih sestavin ne morejo razredčiti z delitvijo. Ko se recikliranje ustavi, se odpadne snovi kopičijo. Ko poteka, celica v stresnih razmerah ponovno pridobi gradnike.

Kaj je pokazal poskus s hipokampalnimi celicami

Osrednja študija indukcije je uporabila mišje hipokampalne celice HT22, izpostavljene stresu zaradi 24-urnega odvzema seruma. Ta pogoj odstrani rastne dejavnike in trofične signale ter sproži tako apoptozo kot avtofagijo. Raziskovalci so poročali, da je metilensko modrilo zmanjšalo odmiranje celic na način, odvisen od odmerka, in da so to zaščito spremljali znaki makroavtofagije.

Vzorec označevalcev je bil specifičen. Difuzno obarvanje LC3B se je začelo prerazporejati v točkaste strukture ob jedru pri približno 20 nM metilenskega modrila, najmočnejši odziv LC3-I in LC3-II pa je bil blizu 1 μM. Tako LC3B-I kot LC3B-II sta naraščala v odvisnosti od odmerka in časa. Ključno je, da je skupina naredila korak dlje od statičnega imunoblota LC3. Dodali so 10 μM klorokina, ki blokira lizosomsko odstranjevanje, in v celicah, obdelanih z metilenskim modrilom, ugotovili višje ravni LC3-II ter stabiliziran p62. Takšen vzorec podpira razlago o od lizosomov odvisnem prometu sestavin, ne zgolj o kopičenju. Pokazali so tudi, da je klorokin delno izničil antiapoptotični učinek, kar v tem modelu povezuje zaščito z avtofagijsko-lizosomsko potjo.

Rezultat glede signalizacije je del, ki se najpogosteje napačno navaja. Signalizacija AMPK, merjena kot fosforilirana AMPK in njena nadaljnja tarča fosforilirana ACC, je pri 12 in 24 urah naraščala v odvisnosti od odmerka. Zaviralec AMPK Compound C, uporabljen pri 20 μM v zadnjih 4 urah, je zmanjšal tako fosforilacijo ACC kot aktivacijo LC3. Nasprotno pa pri fosforilirani mTOR ni bilo zaznavnega zaviranja. V hipokampalnih celicah pod stresom so torej ugotovili indukcijo, povezano z AMPK, po očitno od mTOR neodvisni poti. Enak vzorec se je pojavil pri živih miših, pri katerih je obdelava z metilenskim modrilom inducirala označevalce makroavtofagije v možganski skorji in hipokampusu.

Indukcija še ni zaključen pretok

Tu je razlikovanje med pojmoma najpomembnejše. Indukcija pomeni, da začetni celični mehanizmi tvorijo več avtofagosomov. Pretok pomeni, da vsebina prepotuje celotno pot: zajetje, zorenje, zlitje z lizosomom, razgradnjo in recikliranje. Vsako povečanje LC3-II ostaja trditev o indukciji, dokler test pretoka ne potrdi preostanka poti.

Standardni test pretoka meri LC3-II s kratkotrajno lizosomsko blokado, na primer z bafilomicinom A1 ali klorokinom, in brez nje. Če obdelava res pospeši nastajanje, bi morala blokada razgradnje še dodatno povečati LC3-II. Tandemski reporterski sistem mCherry-GFP-LC3 ponuja še drug vpogled: strukture pred zlitjem z lizosomom svetijo rumeno, potem ko kislo okolje ugasne signal GFP, pa samo rdeče. Več izključno rdečih točkastih struktur zato podpira napredovanje v kisle avtolizosome. Znižanje ravni beljakovine p62 lahko dodatno potrdi promet vsebine, vendar se tudi samo prepisovanje p62 odziva na stres, zato ga je treba preveriti na ravni mRNA.

Spodnji kontrolni seznam povezuje vsako metodo, uporabljeno v tej literaturi, s tem, kaj meri in česa sama ne more dokazati. Bralci ga lahko uporabijo pri vsaki prihodnji trditvi o makroavtofagiji, tudi pri argumentih o postu in dolgoživosti, ki se opirajo na te označevalce.

Upoštevajte terminološko past, na katero opozarja tabela. Fosforilirana ACC je encimsko zavrta oblika. Njen porast kaže odziv, ki ga sproži AMPK, ne aktivacije ACC.

Izraz »zaviranje makroavtofagije je odpravilo nevroprotekcijo« zahteva enako natančnost. V modelu HT22 pomeni, da je poseg v avtofagijsko-lizosomsko pot odpravil prednost pri preživetju, ki jo je metilensko modrilo zagotavljalo ob odvzemu seruma. To podpira avtofagijo kot nujen ali prispevajoč dejavnik v tej celični kulturi. Ne potrjuje, da je avtofagija edini zaščitni mehanizem spojine, ne dokazuje, da klorokin deluje izključno prek avtofagije, za utrditev trditve o vzročnosti pa bi bili potrebni genetski posegi v ATG5, ATG7 ali ULK1.

Dve poti do istega mehanizma

Pomaga poenostavljen prikaz. Energijski stres poveča aktivnost AMPK, AMPK aktivira kompleks ULK1 in avtofagija se začne. Rastni dejavniki in hranila povečajo aktivnost mTORC1, mTORC1 zavira ULK1 in avtofagija ostane izključena. V nadaljevanju poti za ULK1 kompleks Beclin-1 in VPS34 sproži nastanek fagofora, LC3-I se z lipidacijo pretvori v LC3-II, avtofagosom se zapre, zlije z lizosomom, vsebina pa se razgradi skupaj s p62.

Diagram vsako ugotovitev o metilenskem modrilu umesti na ta prikaz: hipokampalni rezultat ob vejo AMPK, rezultat pri progenitorjih pa ob vejo mTOR.

Takšen okvir razreši navidezno neskladje z drugo študijo Xieja in sodelavcev. Pri proliferirajočih podganjih živčnih progenitorskih celicah je ločen poskus pokazal, da je 5 μM metilenskega modrila zaviralo proliferacijo in spodbujalo stanje mirovanja. Število celic, pozitivnih na Ki67, se je zmanjšalo na 1. in 3. dan, medtem ko je že usmerjena diferenciacija v nevrone ostala ohranjena. Tam je mehanizem potekal prek zavrte signalizacije mTOR: zmanjšala sta se skupna mTOR in fosforilirana mTOR, hkrati pa tudi izražanje p70S6K in 4EBP1 ter ciklinov E1, B1, D1 in D2. Prevladujoči fenotip je bilo mirovanje progenitorjev, ki so ga avtorji povezali z odloženim celičnim staranjem, ne z reševanjem hipokampalnih celic pod stresom.

Med člankoma ni protislovja. AMPK in mTOR sta od konteksta odvisna povezovalca signalov, ne nespremenljivi stikali. Nevronu podobna celica pod stresom lahko vključi AMPK brez merljivega zaviranja mTOR, medtem ko se progenitor, katerega rast spodbujajo mitogeni, na isto spojino lahko odzove z omejitvijo od mTOR odvisnih rastnih mehanizmov. Tip celice, vrsta stresa, koncentracija in časovna točka določajo, katera veja prevladuje. Zato v isto sliko sodijo tudi učinki metilenskega modrila na mitohondrijsko energijsko presnovo in redoks procese: kot opisuje pregled mehanizmov nevroprotekcije, spojina deluje kot alternativni prenašalec elektronov, vključuje antioksidativno in antiapoptotično signalizacijo, zavira MAO in NOS ter se prek biogeneze in avtofagije povezuje z obnovo mitohondrijev. Avtofagija je ena veja pleiotropnega profila, ne celotna zgodba.

Česa poskusi ne pokažejo

Odvzem seruma modelira trofični in presnovni stres v celični kulturi. Ne modelira posta celotnega organizma: glukoza, aminokisline in soli ostanejo v osnovnem gojišču, vedenja, povezanega s hranjenjem, pa ni. Koncentracij v kulturi od 20 nM do 5 μM ni mogoče z računskim preračunom pretvoriti v odmerke za ljudi, saj se absorpcija, vezava na beljakovine, redoks stanje, presnova, kopičenje v tkivih in čas izpostavljenosti razlikujejo.

Nobeno preskušanje pri ljudeh ni bilo zasnovano za dokazovanje avtofagijskega pretoka, ki bi ga pri bolnikih induciralo metilensko modrilo. Mehanistični dokazi ostajajo na ravni celičnih poskusov, raziskav ex vivo in raziskav na živalih, pregledni članki pa dokaze o prenosu teh ugotovitev v klinično prakso še vedno opisujejo kot predhodne. Te študije torej ne kažejo, da metilensko modrilo posnema post, podaljšuje človeško življenjsko dobo prek avtofagije ali omogoča zaključitev avtofagijskega pretoka v človeških možganih. Trditve o posnemanju posta in dolgoživosti potrebujejo lastne klinične dokaze, preskušanja metilenskega modrila pri ljudeh za druge indikacije pa zgolj zaradi povezanosti ne postanejo preskušanja avtofagije. Raziskave modelov stresa zaradi pomanjkanja hranil in dolgoživosti je treba brati ob upoštevanju te meje.

Pri naslednjem članku, ki ga boste prebrali, uporabite kontrolni seznam po vrsti. Najprej vprašajte, katera veja se je spremenila: AMPK, mTOR ali nobena. Nato preverite, ali je rezultat LC3 spremljal test pretoka ali pa stoji sam zase. Potem preverite, ali je blokiranje poti odpravilo korist in s katero metodo. Študija, ki odgovori na vsa tri vprašanja, upravičuje močno trditev o mehanizmu. Tista, ki odgovori le na prvo, je pokazala signal, ki dopušča proces, preostanek poti pa ostaja neraziskan.