Članek
Metilensko modrilo in podporne celice možganov: astrociti, mikroglija in vnetje
Predstavljajte si, da izvedete dva poskusa z istim modrim barvilom in dobite dva spodbudna rezultata. V eni posodi zvezdaste podporne celice preživijo pomanjkanje kisika in glukoze. V drugi imunske celice možganov kljub bakterijskemu toksinu ohranijo svojo mirujočo, razvejano obliko. Mamljivo je oba rezultata združiti v eno trditev: barvilo umirja vnetje v možganih in ščiti možgane. Prav pri tem združevanju bi se morali pozorni bralci ustaviti.
Možgani imajo dve populaciji podpornih celic z različnimi nalogami, metilensko modrilo pa se z vsako sreča ob drugačnem eksperimentalnem sprožilcu. Astrociti so celice, ki zagotavljajo presnovno podporo. Ležijo med krvnimi žilami in nevroni, odstranjujejo presežni glutamat, uravnavajo koncentracijo kalija, shranjujejo glikogen in prenašajo gorivo do nevronov, ko potrebe narastejo. Mikroglijske celice so stalne imunske nadzornice. Z drobnimi izrastki nadzorujejo tkivo, zaznavajo bakterijske signale in signale poškodb ter se ob alarmu skrčijo v zaobljeno ameboidno obliko, prilagojeno premikanju in požiranju delcev, pri čemer sproščajo signalne molekule. Rezultata pri eni populaciji ni mogoče prenesti na drugo, uporabljena meritev pa v vsakem primeru določa, kaj je bilo dejansko dokazano.
Astrociti pod presnovnim stresom: ključna ugotovitev je čas dodajanja
Poskus z astrociti se začne z odvzemom. Raziskovalci so gojili astrocite možganske skorje novorojenih miši, jim za šest ur odvzeli glukozo in skoraj ves kisik, nato pa oboje ponovno zagotovili za štiriindvajset ur. To je laboratorijski model možganske kapi, ki ji sledi reperfuzija. Ko je bilo metilensko modrilo prisotno med fazo odvzema, je bilo preživetje celic slabše. Ko so ga dodali šele med fazo ponovne oksigenacije, pri koncentracijah 0.1 in 1 mikromolar, se je preživetje glede na test viabilnosti s kalceinom znatno izboljšalo. Študija mišjih astrocitov poroča o tej razliki glede na čas dodajanja skupaj s podatki o celičnem dihanju.
Ta razlika je najpomembnejša ugotovitev. Med odvzemom skoraj ni kisika, ki bi sprejemal elektrone, zato jih prenašalec elektronov nima kam oddati. Med ponovno oksigenacijo se celični mehanizmi znova zaženejo in barvilo lahko opravlja svojo nalogo. Astrociti, izpostavljeni barvilu, so porabili več kisika, privzeli več glukoze, proizvedli več ATP in obnovili zaloge glikogena, ob večji aktivnosti heksokinaze in brez povečanja mitohondrijskega superoksida. Predlagana razlaga je znana iz opisa metilenskega modrila kot mitohondrijskega prenašalca elektronov: elektrone prenaša mimo blokiranih mest v dihalni verigi, zato se celično dihanje ponovno zažene brez uhajanja elektronov v reaktivne zvrsti.
Bodite pozorni na vrsto teh dokazov. Gre za rezultat o preživetju in presnovi pri eni izolirani vrsti celic, z opredeljenim časovnim oknom učinkovanja (okrevanje, ne odvzem) in opredeljenim razponom koncentracij. Ničesar ne pove o imunski signalizaciji in ničesar o vedenju.
Mikroglija ob bakterijskem alarmu: preprogramirana presnova
Poskusi z mikroglijo se začnejo z nasprotnim sprožilcem: ne s stradanjem, temveč z lažnim signalom okužbe. Lipopolisaharid, del zunanje bakterijske membrane, se veže na senzorje prirojene imunosti in mikrogliji sporoči, da so prispeli patogeni, čeprav živih bakterij ni. Pri miših, ki so prejele lipopolisaharid, in v gojeni mikroglijski celični liniji se sproži znan vnetni program: povečajo se ravni provnetnih dejavnikov, mikroglija se polarizira proti agresivnemu stanju M1, sosednji nevroni odmrejo, živali pa slabše opravljajo naloge učenja in spomina.
Študija tega odziva pri miših ga povezuje s potjo zaznavanja kisika: lipopolisaharid prek predhodne signalne verige Siah2/Morg1 povzroči prekomerno izražanje PHD3, enega od treh encimov prolil hidroksilaze. Hkrati celice preprogramirajo svojo rabo energije v smeri aerobne glikolize, ob povečani ravni mitohondrijskih reaktivnih kisikovih zvrsti. Avtorji so ta premik neposredno izmerili s presnovnimi testi Seahorse, ki merijo porabo kisika in zunajcelično zakisanje. Metilensko modrilo je obrnilo tako presnovni premik kot prekomerno izražanje PHD3, znižalo ravni vnetnih dejavnikov, zmanjšalo odmiranje nevronov in izboljšalo rezultate vedenjskih preizkusov. Pozitronska emisijska tomografija je dodala še slikovne podatke: lipopolisaharid je na FDG-PET povečal privzem glukoze v hipokampusu, obravnava pa ga je ponovno zmanjšala, kar je skladno z umirjeno vnetno presnovo v živih možganih.
Ta nabor meritev je bogatejši kot pri študiji astrocitov (citokini, presnova, slikanje, vedenje živali), vendar se nanaša na drug sprožilec in drugo celico. Bralci, ki primerjajo obe študiji, naj sprožilca obravnavajo ločeno: ena študija med okrevanjem rešuje stradajoče podporne celice, druga pa duši lažni alarm okužbe v imunskih celicah.
Mikroglija pod mikroskopom: oblika kot merilni kazalnik
Tretji poskus preučuje isti bakterijski alarm zgolj prek oblike. V kulturah glijskih celic iz možganske skorje podgan imajo kontrolne mikroglijske celice, obarvane za označevalec IBA1, številne drobne izrastke, značilne za razvejano nadzorno obliko. Po štiriindvajsetih urah izpostavljenosti lipopolisaharidu pri 10 mikrogramih na mililiter celice preidejo v sploščeno ameboidno obliko. Površina njihovega celičnega telesa se poveča, obseg pa ostane približno enak, kar je geometrijski znak zaoblitve. Metilensko modrilo pri koncentraciji 1 mikromolar, dodano skupaj s toksinom, je ohranilo razvejane izrastke ter površino in obseg celičnega telesa blizu kontrolnih vrednosti. Študija na podganjih celičnih kulturah to ohranitev oblike količinsko ovrednoti z meritvami površine in obsega celičnega telesa.
Zaradi dveh podrobnosti je ta študija vredna več kot preprosta slika. Prvič, primerjalna spojina menadion, druga redoks aktivna molekula pri enaki koncentraciji, ni ohranila oblike in je že sama celice usmerila proti aktivirani obliki. Učinek torej ni splošna lastnost vseh molekul, ki sodelujejo v redoks ciklih. Drugič, avtorji učinek barvila povezujejo z aktivacijo Nrf2, transkripcijskega dejavnika, ki uravnava program antioksidativnih in protivnetnih genov, ne zgolj z neposrednim lovljenjem reaktivnih zvrsti. Sorodne obravnave redoks in vnetne signalizacije to povezavo z Nrf2 postavljajo v širši kontekst.
Oblika je kljub temu najšibkejši od treh kazalnikov. Razvejana celica je običajno nadzorna, zaobljena pa običajno aktivirana, vendar je morfologija posredni kazalnik, ne transkript. Ta kultura ni vsebovala imunskih celic iz krvi, nevronskih vezij ali vedenjskega izida.
Vzporedna obravnava treh rezultatov
| Sprožilec | Vrsta celic | Kaj so merili | Kaj je naredilo metilensko modrilo |
|---|---|---|---|
| Odvzem kisika in glukoze, nato njuna ponovna zagotovitev | Mišji astrociti | Viabilnost, porabo kisika, privzem glukoze, ATP, glikogen, superoksid | Zaščitilo je celice le ob dodajanju med ponovno oksigenacijo; povečalo je celično dihanje in zaloge, ne da bi povečalo superoksid |
| Del bakterijskega toksina | Mišja mikroglija v kulturi in pri živih miših | Citokine, označevalce M1, presnovo s testi Seahorse, beljakovine poti PHD3, FDG-PET, spominske naloge | Obrnilo je glikolitično preprogramiranje in prekomerno izražanje PHD3; zmanjšalo je vnetje; izboljšalo je vedenje |
| Del bakterijskega toksina | Podganja mikroglija v mešani glijski kulturi | Površino celičnega telesa, označenega z IBA1, obseg, razvejanost izrastkov | Ohranilo je razvejano mirujočo obliko; menadion je ni |
Vzorec v vseh vrsticah je takšen: vsak sprožilec ima svojo meritev in svoj odgovor. Presnovno reševanje odgovarja na vprašanje o presnovi. Podatki o citokinih in vedenju odgovarjajo na vprašanje o vnetju. Oblika odgovarja na vprašanje o obliki. Noben od teh treh rezultatov sam po sebi ne odgovarja na druga vprašanja.
Česa mikroglija mirnejšega videza ne dokazuje
Celotna tema potrebuje naslednji stavek: mikroglija, ki je videti manj aktivirana, ali spremenjena presnova mikroglije sama po sebi ne dokazuje izboljšanega delovanja možganov.
Morfologija se lahko spremeni, ne da bi ji sledila funkcija. Celica lahko ohrani izrastke in še vedno sprošča citokine ali pa se zaobli, medtem ko koristno odstranjuje celične ostanke. Presnovne meritve imajo enako omejitev: zapis meritev Seahorse ali slika PET pokaže ravnanje z energijo, ne spoznavnih sposobnosti. Mišja študija, ki je presnovne kazalnike in kazalnike, podobne morfološkim, povezala z vedenjskimi preizkusi, je močnejša prav zato, ker je združila več ravni dokazov, namesto da bi celoten sklep oprla na eno meritev. Tudi zanjo veljajo običajne omejitve: lipopolisaharid modelira sterilni alarm, ne resnične okužbe, miši niso ljudje, na razlike med vrstami pa opozarjajo tudi avtorji. Vsakdo, ki načrtuje nadaljnje raziskave, bi moral pretehtati prenosljivost ugotovitev o mikrogliji med modeli, preden predpostavi, da se ta pot v človeškem tkivu vede enako.
Iz tega sledi praktična posledica glede časa dodajanja. Pri astrocitih je zgodnje dodajanje povezano s slabšim izidom, dodajanje med okrevanjem pa z boljšim. Rezultati pri mikrogliji izhajajo iz dodajanja v času okoli vnetnega sprožilca. Poškodba možganov v resničnem življenju združuje obe fazi hkrati: odpoved oskrbe z energijo in imunski alarm, ki se razvijata več ur. Poskus, ki izolira eno fazo, ne more določiti urnika za njuno kombinacijo, zato razprave o časovnih oknih odmerjanja ločeno obravnavajo časovni potek odvzema in vnetja.
Pošten povzetek lahko strnemo v en odstavek. Pri izoliranih astrocitih metilensko modrilo, dodano med ponovno oksigenacijo, ponovno zažene celično dihanje in reši celice. Pri mikrogliji, izpostavljeni bakterijskemu delcu, prek specifične poti PHD3 obrne vnetni presnovni program in ohrani mirujočo obliko. Vsak rezultat velja v okviru svoje eksperimentalne zasnove, nobeden pa ni splošna sodba o vnetju v možganih. Primerjava glijskih celic je koristna prav zato, ker preprečuje, da bi se obe zgodbi zlili v eno.