Metilensko modrilo kot indikator anaerobnih pogojev in kisika: kaj dokazuje sprememba barve

Tehnica zatesni anaerobno posodo, skozi pokrov preveri indikatorski trak z metilenskim modrilom in vidi, kar želi videti. Trak se je iz modrega spremenil v belega. Postopek zabeleži kot anaeroben in nadaljuje delo. Dva dni pozneje na eni plošči ni rasti, medtem ko zaprta epruveta z bujonom v isti posodi kaže znake izpostavljenosti kisiku. Trak je kazal pravilno. Ona mu je postavila napačno vprašanje.

Zmeda izvira iz napačnega razumevanja pojmov. Anaerobni indikator z metilenskim modrilom temelji na redoks procesih, ne na sterilnosti ali validaciji celotnega sistema. Ko je ta razlika jasna, postane trak natančen in zanesljiv pripomoček z ozko določeno nalogo.

Osnovni princip: reverzibilni redoks par

Raztopljeno metilensko modrilo obstaja v dveh oblikah. Oksidirana oblika je znani modri kation. Reducirana oblika, imenovana levkometilensko modrilo, je brezbarvna. Pri skoraj nevtralnem pH poenostavljena polreakcija poteka tako, da en modri kation, en proton in dva elektrona tvorijo eno brezbarvno molekulo levko oblike. Formalni potencial je pri pH 7 približno plus 11 milivoltov glede na standardno vodikovo elektrodo, kar ga uvršča v območje, ki ga lahko dosežejo številni redukcijski sistemi in kjer lahko kisik obrne potek reakcije.

Za redukcijo je potreben nizek lokalni redoks potencial. Sama odstranitev kisika tega ne zagotovi vedno. Zgodnje raziskave anaerobnih pogojev so pokazale, da metilensko modrilo v navadni vodi brez kisika ohrani barvo, če ni prisotna redukcijska snov, in da se mešanice dekstroznega bujona s približno 0.01 odstotka barvila pri 37 C zlahka razbarvajo, medtem ko ista mešanica pri 4 C ostane modra ves dan, kot poročajo poskusi s svežim tkivom in anaerobnimi pogoji gojenja. Temperatura, pH, glukoza, askorbat, tioglikolat in redukcijska aktivnost mikroorganizmov določajo, ali so elektroni na voljo.

Za ponovno oksidacijo zadostuje kisik. Ko zrak doseže levko obliko, se ta ponovno spremeni v modro. Sodobni namensko zasnovani indikatorji izkoriščajo prav ta cikel: barvilo, reducent in stabilizacijska matrica so pri nizki vsebnosti kisika brezbarvni, ob izpostavitvi zraku pa ponovno modri, kot je prikazano pri hibridnem kisikovem indikatorju z metilenskim modrilom na osnovi barvila, reducenta, površinsko aktivne snovi in gline. Ta prototip je uporabljal 0.01 milimolarno barvilo z 2.0 milimolarnim askorbatom ali glukozo pri pH 11, postal brezbarven pri približno 0.5 volumenskega odstotka kisika ter v preskusni komori razlikoval med vsebnostjo kisika pod 0.1 odstotka in nad 0.5 odstotka.

Načelo delovanja je torej preprosto. Modra barva pomeni, da je območje indikatorja oksidirano. Brezbarvnost pomeni, da so v območju indikatorja vzpostavljeni redukcijski pogoji z nizko vsebnostjo kisika. Sprememba je reverzibilna, lokalna in kemijska. Sama po sebi ne pove ničesar o mikroorganizmih.

Kako deluje indikatorski trak z metilenskim modrilom v anaerobni posodi

Indikatorski trak z metilenskim modrilom za anaerobno posodo je majhno reakcijsko območje, nameščeno v atmosferi posode tako, da ga lahko opazujemo brez odpiranja. Komercialne izvedbe se razlikujejo: papirnati trakovi, tablete, ki jih ob pripravi raztopimo ali navlažimo, in novejši hibridni papirji. Nekateri za aktivacijo reakcijskega območja potrebujejo eno kapljico destilirane vode. Drugi so suhi pripomočki, ki morajo ostati suhi. Odločilna so navodila za posamezni izdelek, saj so navlaženost, namestitev in čas odčitavanja del kemijskega delovanja.

Predvideno odčitavanje je v praksi binarno. Modra barva pomeni, da ob traku ostaja kisik ali da pogoji niso dovolj redukcijski. Bela barva ali brezbarvnost pomeni, da so ob traku vzpostavljeni anaerobni redoks pogoji. Nekateri komercialni papirji vsebujejo tudi rdeč pigment za ozadje, zato je njihova končna reducirana barva rožnata namesto bela. Preden presodite rezultat, preverite, katero končno barvo določa vaš izdelek.

Časovni potek se razlikuje glede na sistem. Pri eni postavitvi tipa GasPak se je razbarvanje začelo v približno eni uri in zaključilo v nekaj urah, pri kontrolirani primerjavi pri sobni temperaturi pa je metilensko modrilo potrebovalo več kot šest ur. Redoks potencial gojišča je v tej raziskavi v 60 do 100 minutah dosegel približno minus 100 milivoltov, precej preden je barvilo dokončalo spremembo, in je bil ob popolnem razbarvanju traku precej pod minus 200 milivolti. Indikator zaostaja za spremembo atmosfere. Moder trak po eni uri ne dokazuje neuspeha, bel trak po šestih urah pa opisuje stanje traku po šestih urah.

Iz istega razloga je pomembna tudi namestitev. Trak naj bo v plinskem prostoru nad vsebino, viden skozi pokrov in odmaknjen od površin agarja ter gojišč. Kaže stanje svoje neposredne okolice. Če ga položite plosko ob hladno steno, skrijete pod plošče ali pustite, da ga prepoji kondenzat, bo namesto stanja posode kazal stanje tega mikrookolja.

Kaj trak razkrije in česa ne

Indikator z metilenskim modrilom v anaerobni posodi obravnavajte kot eno tipalo na enem mestu. Pokaže lokalne redoks pogoje in vsebnost kisika v svojem reakcijskem območju, ki sta ob ustreznem mešanju in vzpostavitvi ravnovesja okvirno reprezentativna za plinski prostor nad vsebino. Vse drugo je sklepanje, za sklepanje pa potrebujete ločene dokaze.

Brezbarven trak ne potrjuje sterilnosti. Sterilnost pomeni odsotnost živih organizmov, kar dokazujemo z validirano sterilizacijo in validacijskimi kontrolami gojenja. Posoda je lahko povsem anaerobna in še vedno kontaminirana ali povsem sterilna in še vedno aerobna.

Trak ne potrjuje ustreznosti vsakega dela sistema za gojenje. Raztopljeni kisik v zaprti epruveti, kisik, ujet globoko v agarju, gradienti v prenatrpani posodi in puščanje, ki se pojavi po odčitavanju, ostanejo zunaj dosega enega traku. Poskusi s prostorsko razporeditvijo so pokazali sosednja modra in brezbarvna območja v isti posodi, kjer sta bila prodiranje kisika in redukcijska aktivnost različno uravnotežena. Ena točka ne more potrditi pogojev v celotnem volumnu.

Prav tako ne dokazuje neprekinjenih anaerobnih pogojev. Enkratno odčitavanje traku ob pripravi ne pove ničesar o dvajseti uri. Novejše raziskave zagotavljanja kakovosti pri anaerobnem delu opozarjajo, da kemijski indikatorji opisujejo atmosfero v trenutku odčitavanja in so lahko videti ustrezni kljub majhni količini preostalega kisika. Trak z inkubacijo povezuje neprekinjeno dokumentiranje ali dokumentiranje ob kontrolnih časovnih točkah, ne pa en sam pogled na končno stanje.

Za spremljajočo kemijsko razlago spremembe barve glejte kako metilensko modrilo prehaja med oksidiranim in reduciranim stanjem. Za širši pogled na to, kako kisik vpliva na ravnanje z vzorci, glejte nadzor kisika pri mikroskopiji in gojenju kultur.

Shema, ki jo lahko hranite ob posodi

Spodnja slika povzema članek v enem priročnem prikazu za laboratorijsko mizo. Prikazuje tri stanja istega traku, obe smeri reakcije ter mejo med dokazi, ki jih daje indikator, in validacijo sistema.

Napake, zaradi katerih trak ostane moder ali daje lažen občutek zanesljivosti

Večina napak spada v pet skupin. Vsaka ima značilne znake.

Posoda ali vrečka, ki pušča, nenehno dovaja kisik v reakcijsko območje. Trak ostane moder ali po razbarvanju ponovno pomodri. Preden za težavo okrivite kemijo, preverite pokrov, tesnilo, sponke in tesnilne površine.

Izrabljen ali nepravilno aktiviran generator plina kisika sploh ne odstrani. Pri starejših sistemih, aktiviranih z vodo, sta bila odsotnost kondenzacije po približno 10 do 15 minutah in odsotnost segrevanja pokrova po približno 20 do 40 minutah zgodnja opozorilna znaka za ta sistem. Vrečka s premajhno zmogljivostjo v preobremenjeni posodi odpove na enak način.

Zastrupljen katalizator je težava le pri starejših sistemih z vodikom in paladijem, pri katerih paladij omogoča združevanje vodika in kisika v vodo. Vlaga in vodikov sulfid poslabšata njegovo delovanje. Številne sodobne vrečke paladija sploh ne uporabljajo, zato tega ukrepa ne izvajajte tam, kjer ni ustrezen.

Degradiran trak ali trak, s katerim ste nepravilno ravnali, odpove brez očitnega opozorila. Barvilo in reducent med shranjevanjem izgubljata reverzibilnost, kar je eden od razlogov za razvoj hibridnih formulacij, odpornejših proti bledenju zaradi svetlobe in izgubi funkcionalnosti med shranjevanjem. Izločite zalogo s pretečenim rokom uporabnosti, zalogo z neobičajno začetno barvo in trakove, ki so bili navlaženi, čeprav bi morali ostati suhi, ali so ostali suhi, čeprav bi jih bilo treba navlažiti.

Gradient ali zakasnitev zavedeta osebo, ki odčitava, ne pa kemijskega procesa. Slabo premešan plinski prostor nad vsebino, zaprte epruvete z raztopljenim kisikom in poltrdna gojišča ohranjajo svoje pogoje dlje, kot nakazuje trak. Trakovi z resazurinom prek rožnate barve preidejo v brezbarvno stanje in jih pogosto tržijo kot hitrejše, vendar so njihovi pragovi odvisni od njihove formulacije in jih ni mogoče prenesti na metilensko modrilo.

Kontrole in protokol odčitavanja, ki ju je vredno prevzeti

Dve poceni kontroli odkrijeta večino napačnih razlag. Ob izvajanju postopka hranite svež kontrolni trak na sobnem zraku. Delujoč trak z metilenskim modrilom tam ostane moder. Nekateri zapakirani indikatorji so sprva bledi in ob odprtju pomodrijo, kar je že samo po sebi preverjanje delovanja. Občasno postavite tudi svež trak v predhodno validiran anaerobni sistem. V času, določenem za izdelek, mora doseči validirano končno reducirano stanje. Če katera koli kontrola ne deluje po pričakovanjih, zamenjajte serijo, preden zaupate odčitkom iz posode.

Protokol odčitavanja izhaja iz mehanizma delovanja. Trak namestite v plinski prostor nad vsebino tako, da je viden brez odpiranja posode, pri tem pa upoštevajte navodila za izdelek glede stika s steno in navlaženja. Zabeležite začetno barvo, čas zatesnitve posode in barvo ob kontrolni časovni točki, določeni za izdelek. Če posoda to omogoča, med inkubacijo ob določenih kontrolnih časovnih točkah zabeležite, da je indikator ostal reduciran. Končno barvo zabeležite tik pred odpiranjem. Ta barva pred odpiranjem je končni rezultat tega postopka. Po odpiranju pričakujte ponovno modrenje in ne dovolite, da spremeni razlago prejšnjega stanja.

Če trak ostane moder po predpisanem času, obravnavajte anaerobne pogoje kot nepotrjene. Preverjajte po vrsti: tesnjenje, vrečko, katalizator, če je prisoten, navlaženost indikatorja in rok uporabnosti, nato pa še delovanje indikatorja v primerjavi s kontrolo na zraku. Rast ali odsotnost rasti razlagajte šele po potrditvi atmosfere, pri čemer uporabite postavitev za anaerobno gojenje in kontrole z organizmi, prilagojene namenu uporabe.

Trak ima zadnjo besedo na svojem področju. Moder ali brezbarven odgovarja na eno vprašanje o enem mestu v enem trenutku. To vprašanje mu postavite ob predvidenem času in z ustreznimi kontrolami ob njem, pa bo odgovor zanesljiv. Če ga na podlagi enega samega pogleda sprašujete o sterilnosti, vsaki epruveti ali celotni inkubaciji, razlage ne more rešiti nobena indikatorska kemija.