Merjenje reaktivnih kisikovih zvrsti v poskusih z metilenskim modrilom

Dva laboratorija izvedeta poskus, ki ga vsak poimenuje poskus antioksidativnega delovanja metilenskega modrila. Prvi poroča, da barvilo zavira reaktivne kisikove zvrsti. Drugi poroča, da jih ustvarja. Oba pokažeta jasne krivulje odziva v odvisnosti od odmerka. Oba poročata v dobri veri. Razlika ni posledica goljufije ali nestrokovnosti. Skupini sta merili različne stvari pri različni osvetlitvi, s sondami, ki odgovarjajo na različna vprašanja, nato pa sta oba odgovora opisali z isto besedo: ROS.

Metilensko modrilo je težko natančno meriti, ker sodeluje v kemijskih procesih, ki naj bi jih opazovali. V temi prenaša elektrone med donorji in akceptorji ter se vrne v začetno obliko, pripravljeno na nov cikel. Na svetlobi postane fotosenzibilizator in preide v vzbujeno tripletno stanje, iz katerega lahko prenese energijo na kisik in tvori singletni kisik ali pa prenese elektrone in tvori radikale ter vodikov peroksid. Vsako sondo, vneseno v ta sistem, lahko samo barvilo oksidira, reducira, razbarva ali optično zastre. Zato prvo vprašanje pri katerem koli odčitku ROS nikoli ni, kolikšna je številčna vrednost. Vprašanje je, kaj metoda dejansko zaznava in kako barvilo vpliva nanjo.

Amplex Red: umerjena metoda za merjenje vodikovega peroksida

Kombinacija metilenskega modrila in Amplex Red je ob pravilni izvedbi najbolj utemeljena kombinacija v tej literaturi. Kemijska reakcija je specifična: hrenova peroksidaza uporablja vodikov peroksid za oksidacijo substrata Amplex v fluorescenčni produkt resorufin, v približno stehiometričnem razmerju ena proti ena. Peroksid iz vzorca se pretvori v fluorescenco, ki jo zazna detektor. Nobena druga zvrst iz običajnega nabora ROS te reakcije ne sproži neposredno.

Odločilna prednost je umerjanje. Skrben izvajalec izmeri standarde z znanimi koncentracijami peroksida v istem pufru, z enakimi koncentracijami peroksidaze in substrata, enakim časom inkubacije ter enakimi optičnimi nastavitvami, nato pa vzorce ovrednoti glede na to krivuljo. V raziskavi izoliranih možganskih mitohondrijev, na kateri temelji ta metoda, so avtorji naredili prav to: ob koncu vsake meritve so dodali znane količine peroksida, rezultate pa navedli kot hitrosti v pikomolih na minuto na miligram beljakovin namesto v poljubnih fluorescenčnih enotah. Prav to spremeni sij v meritev.

Tri podrobnosti iz te raziskave je vredno posnemati. Prvič, avtorji so signal preverili s katalazo, ki razgrajuje peroksid. Povečevanje fluorescence, ki ga je povzročilo metilensko modrilo, se je ob dodatku katalaze ustavilo, kar je potrdilo, da signal izvira iz peroksida in ni optični artefakt. Drugič, neposredno so preverili vpliv osvetlitve: z zaslonko so omejili vzbujevalni žarek, tako da so vzorci prejeli eno osmino običajnega svetlobnega odmerka, signal pa se je zmanjšal le za devet odstotkov. Več kot devetdeset odstotkov peroksida, o katerem so poročali, je bilo neodvisnega od merilne svetlobe. Tretjič, odstranjevanje peroksida so ločeno merili z elektrodo in ugotovili, da barvilo hkrati poveča njegovo nastajanje in upočasni odstranjevanje. Sonda, ki poroča le o neto fluorescenci, bi ta dva učinka združila v enega.

Metoda ima kljub temu šibke točke in metilensko modrilo jih razkrije več. Barvilo močno absorbira v širokem območju istega rdečega dela spektra, v katerem resorufin oddaja svetlobo, zato lahko vzorec pri visokih koncentracijah barvila zaradi učinkov notranjega filtra zastre lasten signal. Standardi morajo zato vsebovati enako koncentracijo barvila kot vzorci. Amplex Red se lahko tudi sam fotooksidira, njegov produkt resorufin pa lahko vstopi v fotoredoksne cikle, ki ustvarjajo superoksid in peroksid. To je še posebej pomembno, kadar v poskusu osvetljujemo tudi fotosenzibilizator. Praktična rešitev je, da najprej obsevamo vzorce metilenskega modrila, nato pa njihove alikvote analiziramo z reagenti Amplex v temi, namesto da bi barvilo in sondo osvetljevali skupaj. Nazadnje superoksid dismutaza signala Amplex ne zmanjša nujno: pretvorba superoksida v peroksid ga lahko poveča. Kontrola s SOD, ki poveča fluorescenco, ni neuspešna. Pokazala je, da je superoksid predhodna zvrst v reakcijski poti.

DCFDA: nespecifični kazalnik oksidacije

Kombinacija metilenskega modrila in DCFDA je vir večine zmede. DCFH-DA je predhodnik, ki se vnese v celice. Esteraze v celici odstranijo njegove acetatne skupine, pri čemer ostane nefluorescenčni DCFH, oksidacija DCFH pa ustvari fluorescenčni DCF. Seznam snovi, ki ga oksidirajo, je dolg: hidroksilni radikali, intermediati peroksidaznih in hemskih reakcij, dušikov dioksid, hipoklorova kislina ter radikali, nastali iz peroksinitrita. Sam vodikov peroksid ga neposredno ne oksidira s hitrostjo, uporabno za merjenje; fluorescenca, odvisna od peroksida, običajno zahteva sodelovanje železa, hemskih beljakovin ali peroksidaznih reakcij.

Kritična presoja, ki bi jo moral navajati vsak razdelek o metodah, izhaja iz analize DCFH kot sonde, ki so jo opravili Kalyanaraman in sodelavci. Kot je povzeto v raziskavi možganskih mitohondrijev, ki je iz tega razloga zavrnila DCFDA, so pokazali, da barvilo reagira počasi, z neopredeljeno stehiometrijo, brez veljavnega umerjanja in tudi s spojinami, ki niso ROS. Sonda poleg tega ojača proces, ki ga meri: enoelektronska oksidacija DCFH ustvari radikal DCF, ki reagira s kisikom in tvori superoksid, ta pa z dismutacijo ustvari dodaten peroksid. Meritev deloma sama ustvarja kemijske procese, o katerih poroča.

Zaradi tega DCFDA ni neuporaben. Je pa presejalni kazalnik, ne sredstvo za identifikacijo. Povečanje fluorescence DCF pomeni, da se je povečala oksidacija sonde, odvisna od oksidantov. Ne pomeni, da se je povečala količina peroksida, in zagotovo ne pomeni, da se je povečala skupna količina ROS, saj te ne meri nobena posamezna sonda. Zgodnejše raziskave metilenskega modrila, ki so se opirale na oksidacijo DCF pri koncentracijah nad enim mikromolom na liter, so poročale o prooksidativnih učinkih, medtem ko so drugi sistemi v istem obdobju pokazali zaščito pred celično smrtjo, povzročeno s peroksidom. Obe opažanji sta lahko veljavni za isto barvilo v različnih redoksnih okoliščinah, sam rezultat DCF pa ne more povedati, kateri oksidant je povzročil signal. Pomen zgodnejše raziskave možganskih mitohondrijev je v tem, da je ta presejalni kazalnik nadomestila z umerjeno meritvijo peroksida in neposredno ugotovila obremenitev: že sto nanomolov barvila na liter je večkrat povečalo sproščanje peroksida pri vsakem preizkušenem substratu in stanju dihanja.

DCFDA ima še eno past, značilno za metilensko modrilo. Barvilo je intenzivno obarvano in redoksno aktivno, zato lahko zmanjša fluorescenco, duši emisijo ali oksidira sondo neodvisno od celičnih ROS. Brezcelična kontrola z barvilom in sondo, vendar brez celic, ni neobvezen dodatek. To je poskus, ki pove, ali barvilo neposredno vpliva na sondo.

Spinsko lovljenje in poraba kisika: identiteta in tok

Medtem ko fluorescenčne sonde kažejo, da se je pojavilo nekaj, kar lahko povzroči oksidacijo, elektronska spinska resonanca s spinskimi lovilci poda odgovor, ki je bližje identiteti te zvrsti. Klasična raziskava fotokemije metilenskega modrila je uporabila ESR za zaznavanje askorbatnega radikala v sistemu z barvilom, askorbatom in svetlobo, nato pa s poskusi porabe kisika pokazala nastajanje peroksida in s poskusi spinskega lovljenja nastajanje hidroksilnih radikalov, katalizirano z železom. Vsaka tehnika je odgovorila na vprašanje, na katero druge niso mogle: ESR je razkrila identiteto radikala, poraba kisika je pokazala reakcijski tok neodvisno od katere koli fluorescenčne sonde, kombinacija pa je pokazala, da v istem osvetljenem sistemu potekajo tako poti s singletnim kisikom kot radikalske poti.

Rezultat iz leta 1984 še vedno deluje kot opozorilo. Ob osvetlitvi in prisotnosti reducenta je barvilo ustvarjalo peroksid, ob prisotnosti železa pa je sistem tvoril hidroksilni radikal, najbolj reaktivno zvrst v tem naboru. Avtorji so to povezali z askorbatom v očesu in podvomili o nepremišljeni oftalmološki uporabi. Današnji bralci naj bodo pozorni na pogoje: svetloba, reducent in železo. Če odstranimo katerega koli od njih, pot oslabi ali izgine.

Kisikove elektrode svojo vrednost dokazujejo drugače. Elektroda Clarkovega tipa meri neto porabo kisika, s čimer potrdi, da redoksni procesi, ki jih poganja barvilo, porabljajo molekularni kisik, in poda kinetiko, ki je noben fluorescenčni artefakt ne more ponarediti. Ne opredeli pa produkta. Nastajanje peroksida, superoksida in vode ter razpad singletnega kisika vsi porabljajo kisik. Tok brez identitete je prav tako nepopoln kot identiteta brez toka, zato kakovostne raziskave elektrodo združujejo z umerjeno metodo za merjenje peroksida ali z lovilcem.

Zakaj si rezultati o antioksidativnem delovanju nasprotujejo

Če tri vrste odčitkov postavimo drugo ob drugo, se navidezna protislovja v literaturi o metilenskem modrilu razjasnijo kot razlike v metodah in tri biološka dejstva.

Prvič, barvilo je hkrati prenašalec elektronov in vir peroksida. S preusmerjanjem elektronov stran od mest v dihalni verigi, kjer bi se kisik sicer pretvoril v superoksid, lahko zmanjša eno zvrst ROS, medtem ko njegova reducirana oblika kisik neposredno reducira v peroksid in poveča drugo. Laboratorij, ki preučuje mitohondrijsko redoksno kemijo in njegovo vlogo obvodnega prenašalca, mora zato pričakovati odgovore, odvisne od sonde: v isti kiveti se odčitek, občutljiv za superoksid, zmanjša, odčitek peroksida pa poveča.

Drugič, peroksid pri nizkih odmerkih deluje kot signal, ne povzroča le poškodb. Raziskava mitohondrijev mišjih možganov, ki je sledila zgodnejšemu delu, je ugotovila nastajanje peroksida že pri petdesetih nanomolih barvila na liter brez poškodb mitohondrijske DNA pri terapevtskih ravneh, po predhodni obdelavi pa zaščito pred poškodbami, povzročenimi z rotenonom. Šele pri sto mikromolih na liter, kar je daleč nad terapevtskim območjem, je barvilo poškodovalo izbrane fragmente DNA, rdeča svetloba skupaj z dvajsetimi mikromoli barvila na liter pa je ustvarila singletni kisik, ki je poškodoval vse preizkušene fragmente. Predlagani mehanizem je hormetičen: blago nastajanje peroksida sproži antioksidativne obrambne mehanizme, povezane z Nrf2, in mitohondrijsko biogenezo, zato kratkoročnemu prooksidativnemu odčitku sledi dolgoročnejši antioksidativni izid. Meritev po eni uri in meritev po enem dnevu se lahko razlikujeta, ker so se vmes spremenili biološki procesi.

Tretjič, svetloba določa, katera molekula je sploh prisotna. Osvetlitev povzroča demetilacijo barvila v smeri Azure B in sorodnih produktov, za njegovo fotosenzibilizacijo pa zadostuje že mikroskopska svetilka nad posodico. Poskusi v temi in osvetljeni poskusi so različni poskusi, zato jih mora razdelek o kontrolah osvetlitve in ravnanja z barvilom v vsakem protokolu tudi tako obravnavati.

Najmanjši nabor kontrol in kako presojati katero koli trditev

Spodnja primerjava je izvirno referenčno gradivo tega članka. Preden sprejmete kateri koli rezultat merjenja ROS pri metilenskem modrilu, preverite, katero vrstico so avtorji izpolnili in katero izpustili.

Iz tega sledi praktično pravilo za presojo. Umerjena metoda Amplex s peroksidazo in preverjanjem s katalazo daje dokaze o peroksidu. DCFDA daje dokaze o nespecifični oksidaciji sonde in nič več. Spinsko lovljenje s kontrolami z lovilci radikalov daje dokaze o identiteti radikala. Poraba kisika daje dokaze o toku. Stavek, ki trdi več, kot lahko podpre uporabljena metoda, je ne glede na samozavesten zapis stavek o sondi, ne o barvilu. Povezane razprave o odvisnosti od odmerka in hormetičnem območju, mitohondrijskem toku elektronov, motnjah meritev v obarvanih vzorcih ter artefaktih mikroskopske osvetlitve dodatno obravnavajo vsako od teh točk; vsaka ostane veljavna tudi po zamenjavi začasnega sklica.