Razlaga Loefflerjevega alkalnega in polikromnega metilenskega modrila

Na delovni mizi za barvanje lahko druga ob drugi stojijo tri steklenice, vsaka označena z neko različico metilenskega modrila. Na eni piše 1% vodno metilensko modrilo. Na drugi Loefflerjevo alkalno metilensko modrilo. Na tretji polikromno metilensko modrilo. Zaposleni v naglici poseže po najbližji. Razmaz se nato obarva prešibko, preveč enakomerno modro ali v nepričakovanih vijoličnih odtenkih, krivdo za rezultat pa pripišejo vzorcu.

Težava je v formulaciji, ne v vzorcu. Te tri raztopine vsebujejo sorodna barvila, vendar temeljijo na različnih načelih barvanja. Ena je navadno kationsko barvilo pri skoraj nevtralnem pH. Druga je isto barvilo, katerega delovanje okrepi alkalija. Tretja sploh ni več eno samo barvilo, temveč načrtno oksidirana mešanica. Če uporabite napačno raztopino, se med delom spremeni načelo barvanja.

Kratek odgovor

Navadno vodno metilensko modrilo je izhodišče: približno 1% barvila v vodi, preprosto kationsko barvilo za prikaz morfologije bakterij in splošno mikroskopijo. Pri Loefflerjevem alkalnem metilenskem modrilu alkoholni osnovni raztopini, razredčeni z vodo, dodamo majhno, odmerjeno količino razredčene alkalije. S tem zvišamo pH in okrepimo vezavo kationskega barvila na kisle bakterijske strukture. Polikromno metilensko modrilo je metilensko modrilo, ki je načrtno zorelo z oksidacijo v alkalnem okolju. Steklenica zato poleg preostalega metilenskega modrila vsebuje mešanico demetiliranih homologov (azure A, azure B, azure C), tionina in metilenskega vijoličnega barvila, ta mešanica pa različne strukture obarva v različnih odtenkih.

Če si zapomnite le en stavek: alkalizacija spremeni intenzivnost barvanja, polikromiranje pa spremeni barvne odtenke.

Navadno vodno metilensko modrilo: referenčna točka

Najpreprostejša formulacija je metilensko modrilo, raztopljeno v vodi, običajno pri 1% w/v, brez alkalije in brez oksidacije. Obarvana kemijska zvrst je metiltioninijev kation s kloridnim protiionom, majhno ploščato fenotiazinsko barvilo, ki je v zapisu o metilenskem modrilu v zbirki PubChem opisano kot metiltioninijev klorid. Kot kation se veže na fosfatno ogrodje nukleinskih kislin in kisle skupine v bakterijskih celičnih stenah ter celice obarva modro na svetlem ozadju.

Njegova prednost je predvidljivost. Jedra in bakterije so modri. Kontrast je zmeren. Slabo vidni mikroorganizmi se lahko obarvajo šibko, kar je prav omejitev, ki jo je Loeffler želel odpraviti. Za širšo skupino preprostih bakterijskih barvanj, v katero sodi ta raztopina, si oglejte pregled preprostega barvanja bakterij. Tudi tu je pomembno natančno preverjanje identitete: metilno modrilo je povsem druga molekula, kot pojasnjuje članek metilno modrilo v primerjavi z metilenskim modrilom, zato lahko iskanje po katalogu zgolj na podlagi imena barve privede do napačne skupine barvil.

Loefflerjevo alkalno metilensko modrilo: isto barvilo z okrepljenim delovanjem

Klasični Loefflerjev recept združuje alkoholno osnovno raztopino metilenskega modrila z razredčeno alkalijo v vodi. Učbeniške različice predpisujejo 0.3 g barvila v 30 mL 95% etanola ter 100 mL 0.01% vodne raztopine kalijevega hidroksida (ali enakovredno 30 mL nasičene alkoholne raztopine metilenskega modrila, 100 mL destilirane vode in 1 mL 1% KOH). Tako dobimo delovno raztopino s približno 0.3% barvila pri izrazito alkalnem pH. Komercialne različice sledijo istemu načelu, katalog mikrobioloških barvil Thermo Fisher pa Loefflerjevo alkalno metilensko modrilo navaja poleg polikromne in vodne različice kot ločene kataloške izdelke z različnimi predvidenimi uporabami.

Ključno vlogo ima alkalija. Zvišanje pH povzroči deprotonacijo karboksilnih in fosfatnih skupin v preparatu ter poveča gostoto negativno nabitih vezavnih mest. Alkoholna osnovna raztopina medtem ohranja barvilo povsem raztopljeno, tako da do teh mest pride v monomerni obliki. Rezultat je hitrejše in intenzivnejše barvanje bakterij kot pri nevtralnem vodnem barvilu, z značilnimi temno modrimi paličkami in koki rutinskega bakteriološkega razmaza. Barvanje običajno traja eno do tri minute, nato sledi spiranje z vodo.

Klasična uporaba je barvanje bakterije Corynebacterium diphtheriae, gojene na Loefflerjevem serumskem gojišču: vitkih, pogosto kijastih paličk z močno obarvanimi metakromatskimi Babes-Ernstovimi zrnci, v katerih je shranjen polifosfat. Povezava med gojiščem in barvilom je zgodovinska, saj oboje pripisujejo istemu bakteriologu, kontrast zrnc pa zagotavlja diagnostično korist. Poleg dela z davico se barvilo uporablja kot splošno bakteriološko barvilo za razmaze kultur, za prikaz morfologije bakterij Neisseria v kliničnih razmazih in povsod, kjer barvanje po Gramu ni potrebno, navadno vodno modrilo pa daje prešibko obarvanje. Gre za enobarvno barvilo. Vse kisle strukture se obarvajo v nekem modrem odtenku. Kadar protokol zahteva razlikovanje po barvi, ga sama alkalija ne more zagotoviti.

Praktično opozorilo: alkalne raztopine barvil se med shranjevanjem in ob absorpciji ogljikovega dioksida razgrajujejo ter tvorijo oborino. Laboratoriji zato bodisi pripravljajo manjše količine bodisi kupijo kataloško raztopino in upoštevajo njen rok uporabnosti, namesto da bi še naprej uporabljali staro steklenico, iz katere se na vsako predmetno stekelce odlaga usedlina.

Polikromno metilensko modrilo: eno ime, več barvil

Polikromno metilensko modrilo izhaja iz istega barvila, vendar ga podvržemo nadzorovani oksidaciji v alkalnem okolju, kar so zgodovinsko imenovali zorenje ali polikromiranje. Staranje v alkalnem okolju, segrevanje s karbonatom ali oksidacija s sredstvi, kot je dikromat, postopoma odstranjujejo metilne skupine z dimetilamino substituentov. Nastane mešanica: preostalo metilensko modrilo ter azure B (izguba ene metilne skupine), azure A in azure C (nadaljnja demetilacija), tionin (popolnoma demetiliran) in stranski produkti oksidacije iz skupine metilenskih vijoličnih barvil. Vsaka sestavina ima svoj odtenek in afiniteto do tkiv, zato mešanica barva metakromatsko: jedra, zrnca, mucini in hrustanec se obarvajo v različnih odtenkih od modre do rdečevijolične.

Ista kemija je tudi osnova znamenitih barvil za kri. Zgodnji raziskovalci so ugotovili, da alkalizirano metilensko modrilo obarva jedra povzročiteljev malarije v vijoličnih odtenkih, vendar so bile njihove zorjene vodne raztopine nestabilne in so v nekaj dneh tvorile oborino. Pregled nastanka vijoličnega barvila za kri opisuje, kako sta Malachowski in Romanowsky leta 1891 neodvisno izkoristila ta učinek, kako so uvedli metanol za stabilizacijo oborine barvila in fiksacijo razmazov brez segrevanja ter kako je Giemsa pozneje standardiziral mešanico na podlagi odmerjenega azure B in eozina s stabilizacijo z glicerolom. Sodobna barvila tipa Giemsa izvirajo neposredno iz kombinacije polikromnega metilenskega modrila in eozina, ki povzroči Romanowskyjev učinek. Za podrobnosti o kombinaciji z eozinom in sestavini azure B glejte barvila tipa Romanowsky in interakcijo med azure B ter eozinom.

Ker je polikromno metilensko modrilo mešanica, je že po naravi najmanj standardizirano od teh treh barvil. Njegovo natančno razmerje odtenkov je odvisno od postopka in obsega oksidacije. Zato ga dobavitelji za histologijo prodajajo kot samostojen izdelek z lastnim preverjanjem uporabnih lastnosti, ne pa kot postarano Loefflerjevo barvilo. Značilne uporabe vključujejo metakromatski prikaz zrnc mastocitov, mucinov in hrustanca, podrobnosti plazmatk ter prikaz Helicobacter pylori v tkivnih rezinah s polikromnimi metodami tipa Goodpasture. Je prava izbira, kadar želimo strukture razlikovati po barvi, in napačna, kadar protokol pričakuje jasno enobarvno silhueto bakterij.

Primerjava formulacij in namenov

Preglednico berite kot vodilo za odločanje. Če se preparat obarva prešibko, spremenite pristop glede pH in posezite po Loefflerjevem barvilu. Če se obarva vse, vendar se strukture med seboj ne razlikujejo, spremenite pristop glede sestave barvila in posezite po polikromnem. Če Loefflerjevo barvilo v razmazu lepo prikaže zrnca, nadrejeni pa vpraša, zakaj so jedra in citoplazma enako modri, je odgovor, da nobeno alkalno enobarvno barvilo ne more opraviti te naloge. To vprašanje sodi v skupino polikromnih barvil in njihovih izvedenk za barvanje krvi.

Kako se izogniti običajnim zamenjavam

Za večino zmede sta odgovorni dve napaki. Prva je obravnavanje Loefflerjevega barvila kot zamenljivega z navadnim metilenskim modrilom, ker sta v steklenici obe modri. Razlikujeta se po pH in intenzivnosti, zamenjava z nevtralnim barvilom tam, kjer je predpisano Loefflerjevo, pa odpravi prav tisti kontrast zrnc, na katerem temelji protokol. Druga je obravnavanje katerega koli starega ali nenamerno postaranega alkalnega modrila kot polikromnega. Nenadzorovano staranje ustvari neznano mešanico neznane jakosti, prave polikromne raztopine pa se pripravljajo po določenih oksidacijskih postopkih in se v skupini barvil za kri kombinirajo z odmerjenim eozinom. Zgodovina je tu poučna: nestabilne zorjene vodne raztopine iz 1890-ih so nadomestile stabilizirane metanolne formulacije prav zato, ker nenadzorovanih mešanic ni bilo mogoče reproducirati. Tega nauka se je vredno spomniti, preden diagnostični preparat obarvate z vsebino steklenice neznane starosti.

Doslednost pri poimenovanju sklene krog. Na etiketi preverite kataloški izdelek (vodno, Loefflerjevo ali polikromno modrilo), vsebnost barvila in predvideno uporabo, namesto da sklepate po barvi. Vse tri formulacije imajo skupen izvorni kromofor. Nimajo pa skupnega namena.