Merjenje mitohondrijskih učinkov metilenskega modrila: kisik, ATP in membranski potencial

Predpostavimo, da laboratorij doda metilensko modrilo mitohondrijem z okvarjenim dihanjem in opazi povečanje porabe kisika. Samoumevno se zdi zapisati, da je barvilo obnovilo delovanje mitohondrijev. Ta trditev je lahko napačna. Pretok kisika, sinteza ATP in membranski potencial so trije različni pojmi. Povezuje jih isti organel, podobno kot varnostno kopiranje, sinhronizacijo in deljenje povezuje ista mapa v oblaku: so povezani, vendar zanje veljajo različna pravila. Če enega zamenjamo z drugim, je razlaga napačna, tudi če je vsaka meritev tehnično pravilna.

Pri metilenskem modrilu je takšna zmeda verjetna, ker sodeluje v sistemu, ki ga merimo. Je snov, ki kroži med redoks stanji, sprejema elektrone na začetku poti in jih oddaja v nadaljnjih korakih, lipofilni kation, ki se kopiči v energiziranih mitohondrijih, ter izrazito modra spojina, ki absorbira in oddaja svetlobo v istih spektralnih pasovih kot običajne sonde. Ena sama meritev temu ni kos. Zanesljiv pristop, prikazan v budimpeštanskih raziskavah mitohondrijev, je merjenje pretoka kisika skupaj s hitrostjo sinteze ATP, membranskim potencialom in sproščanjem vodikovega peroksida, pri čemer vsak korak vključuje kontrole, prilagojene barvilu.

Respirometrija meri pretok kisika, ne energijskega izplena

Respirometrija z visoko ločljivostjo, bodisi z instrumentom Oroboros Oxygraph bodisi z analizatorjem zunajceličnih pretokov Seahorse, pokaže eno stvar: kako hitro se kisik reducira. Ne pokaže, koliko protonov se je prečrpalo na elektron, kolikšen del gradienta se je ohranil ali ali ga je ATP-sintaza izkoristila.

Izrazje je pomembno. Pri izoliranih mitohondrijih substrat brez ADP omogoča merjenje dihanja zaradi puščanja protonov, substrat z nasičujočo koncentracijo ADP omogoča merjenje zmogljivosti oksidativne fosforilacije, titracija z razklopnikom pa omogoča merjenje največje zmogljivosti prenosa elektronov. Pri nepoškodovanih celicah so ustrezne meritve s sistemom Seahorse bazalno dihanje, na oligomicin občutljivo dihanje, povezano s sintezo ATP, puščanje protonov, največje dihanje, določeno s FCCP, in nemitohondrijska poraba kisika, odporna na rotenon in antimicin. Poimenovanje rezultatov sistema Seahorse kot stanje 3 in stanje 4 pripisuje preparatu natančnost, ki je ne omogoča, kot jasno kaže okvir testa Agilent Mito Stress Test.

Metilensko modrilo prekine intuitivno povezavo med več kisika in več energije. V izoliranih mitohondrijih možganov morskih prašičkov je barvilo pri koncentracijah od 100 nM do 1 uM povečalo porabo kisika v mirovanju ob uporabi glutamata z malatom, sukcinata in alfa-glicerofosfata kot substratov, pri alfa-glicerofosfatu za približno 64 odstotkov. Vendar je dihanje zdravih mitohondrijev, spodbujeno z ADP, ostalo skoraj nespremenjeno, kot navaja raziskava izoliranih možganskih mitohondrijev. Ker se je dihanje zaradi puščanja povečalo, pretok, spodbujen z ADP, pa je ostal nespremenjen, se izračunano razmerje dihalne kontrole zmanjša. To zmanjšanje ne pomeni, da je barvilo poškodovalo mitohondrije. Pomeni, da je barvilo običajnemu dihanju dodalo redoks cikel, ki porablja kisik. Test porabe kisika z metilenskim modrilom, ki poroča le o povečanju, je izmeril resničen kemijski proces, ni pa povedal ničesar o ohranjanju energije.

Poskusi obnove delovanja kažejo enako neskladje v večjem obsegu. Ob blokiranem kompleksu I se je pretok kisika povečal približno trikrat, sinteza ATP pa le približno 1.5-krat. Do elektrode je prišlo več kisika. Manjši delež njegove porabe je prispeval k nastanku ATP. Vsaka trditev o izboljšani oksidativni fosforilaciji potrebuje tudi podatke o ATP, najbolje izražene kot razmerje ATP na kisik z navedeno konvencijo za imenovalec.

Testi ATP merijo hitrost sinteze, ki je vsebnost ne more nadomestiti

Test ATP odgovarja na drugo vprašanje: koliko ATP nastane na časovno enoto. Kinetična meritev, bodisi spremljanje luminiscence luciferaze kresničk skozi več minut bodisi sklopljen test s heksokinazo in glukoza-6-fosfat dehidrogenazo z odčitavanjem pri 340 nm, poda hitrost. Enkratna meritev skupnega ATP ob končni časovni točki poda vsebnost, ki odraža sintezo minus porabo in sama po sebi pove malo o oksidativni fosforilaciji.

Budimpeštanska skupina je uporabila sklopljeno encimsko metodo z zavrto adenilat kinazo in ugotovila, da je metilensko modrilo pri 1 do 2 uM zmerno, vendar statistično značilno povečalo nastajanje ATP v mitohondrijih, obdelanih z rotenonom ali antimicinom. To je resnična obnova delovanja, vendar je delna. Raziskava toksičnosti TEGDMA je v drugem modelu prišla do podobnega rezultata: 5 mM zobozdravstvenega monomera TEGDMA je zmanjšalo dihanje, povezano s kompleksom I, s približno 286 na 28 enot pretoka, 2 uM barvila pa ga je povečalo na približno 86.

Pri obarvani redoks spojini sta dve kontroli nujni. Prvič, uporabite oligomicin, da ugotovite, kolikšen del izmerjene sinteze ATP je odvisen od ATP-sintaze. Drugič, v sistemu brez celic preverite izkoristek dodane znane količine ATP ob prisotnosti celotne reagentne mešanice in natanko tistih koncentracij barvila, ki jih uporabljate, najmanj 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM in 2 uM. Barvilo lahko absorbira oddano svetlobo, zavira reporterski encim ali spremeni redoks kemijo reagentov, splošne smernice za teste z luciferazo pa prav za to vrsto motenj priporočajo dodatne biokemijske kontrolne teste. Ne predpostavljajte, da pri 1 uM ni artefaktov samo zato, ker je dušenje običajno izrazitejše pri višjih koncentracijah.

Sonde za membranski potencial merijo porazdelitev barvila, ne pretoka

Safranin O, TMRM in TMRE, rodamin 123 ter JC-1 so kationi, ki prehajajo skozi membrane. V negativno nabitem matriksu se kopičijo skladno z elektrokemijskim ravnotežjem, zato skupna fluorescenca posredno odraža potencial prek porazdelitve sonde. Nobena od njih ne meri ATP ali pretoka elektronov.

Vsaka sonda je primernejša za določen preparat. Safranin O je primeren za izolirane mitohondrije in permeabilizirane celice, običajno pri približno 2 uM, z vzbujanjem okoli 495 nm in emisijo okoli 585 nm. Deluje v režimu dušenja, v katerem privzem spremeni skupno fluorescenco. TMRM in TMRE sta primerna za nepoškodovane celice pri nizkih nanomolarnih koncentracijah vnosa v načinu brez dušenja, kjer depolarizacija sprosti barvilo in mitohondrijska fluorescenca upade; pri visokem vnosu se lahko smer signala zaradi samodušenja obrne. JC-1 omogoča priročno razmerje med zelenim in rdečim signalom, vendar je odvisen od vnosa in mitohondrijske mase, zato je za kvantitativno delo manj primeren kot skrbno nadzorovan TMRM. Ti kompromisi so povzeti v pogosto uporabljenem pregledu sond za mitohondrijski membranski potencial.

Metilensko modrilo povzroča optične motnje prav pri delovnih koncentracijah. Njegovi absorpcijski pasovi okoli 600 do 665 nm se prekrivajo z rdečo emisijo sond, zato so verjetni učinki notranjega filtra, dušenje in absorpcija vzbujevalne svetlobe. Barvilo je tudi drugi lipofilni kation, katerega lastna porazdelitev se spreminja s potencialom, ki ga merimo. Zaščita so dodatne neodvisne meritve in slepi vzorci: samo sonda, samo barvilo, sonda z vsako koncentracijo barvila, popolna depolarizacija s FCCP kot ničelna referenca in po možnosti druga optično različna sonda. Raziskava obvoda kompleksa III je pokazala tak pristop, ko je po inhibiciji z antimicinom in miksotiazolom ponovila meritev obnove membranskega potenciala tako s safraninom O kot s TMRM ter dobila enako kvalitativno obnovo. En optični reporter je namig. Dva neodvisna reporterja sta dokaz.

Trije preparati, tri različna vprašanja

Izolirani mitohondriji, permeabilizirane celice in nepoškodovane celice niso zamenljive nastavitve občutljivosti istega testa. Gre za različne pristope z različnimi načeli delovanja.

Izolirani mitohondriji ohranijo elektronsko transportno verigo, notranjo membrano in mehanizme matriksa, medtem ko odstranimo plazemsko membrano, citosol in mrežno arhitekturo. Ta odstranitev je bistvo pristopa: substrati, ADP, inhibitorji in koncentracije barvila so natančno določeni, zato lahko opredelimo pot. Cena za to je izguba naravne oskrbe s substrati, signalizacije in energijskih potreb.

Permeabilizirane celice ohranijo mitohondrije znotraj večjega dela celične arhitekture, obenem pa omogočajo prehajanje eksogenih substratov in ADP skozi odprto plazemsko membrano. So pravo orodje za opredelitev okvare poti presnove substratov v celičnem okolju. Čezmerna permeabilizacija poškoduje zunanjo membrano, citosolna regulacija pa se izpere.

Nepoškodovane celice ohranijo vse: pregrado plazemske membrane, citosolne reducente, endogeni transport substratov, mitohondrijsko mrežo in potrebe po ATP. So najbližje fiziologiji in najbolj oddaljene od neposredne opredelitve mehanizma, saj privzem, redukcija in sekvestracija barvila vsi vplivajo na dejansko izpostavljenost mitohondrijev.

Raziskava TEGDMA je načrtno uporabila vse tri ravni: izolirane možganske mitohondrije za preučevanje obnove oksidacije in potenciala z barvilom, permeabilizirane matične celice zobne pulpe predvsem za lokalizacijo okvare na oksidacijo substratov, povezano s kompleksom I, ter nepoškodovane matične celice za fiziološki neto učinek 2 uM barvila na zmanjšano porabo kisika. Bralcem, ki primerjajo mitohondrijske meritve med preparati, spremljevalni pojasnjevalni članek o tem, kako metilensko modrilo prenaša elektrone skozi dihalno verigo, poda ozadje teh poti, vodnik za razumevanje raziskav dihanja z metilenskim modrilom pa pojasnjuje izbiro koncentracij in inhibitorjev.

Kontrole, ki jih zahteva redoks aktivno barvilo

Snov, ki kroži med redoks stanji, potrebuje daljši seznam kontrol kot običajen inhibitor, saj lahko kemijski procesi samega barvila posnemajo biološke procese.

Pri respirometriji uporabite komoro samo s pufrom za preverjanje drsenja signala, komoro s pufrom in barvilom brez biološkega materiala, barvilo skupaj z vsakim zunajceličnim reducentom, prisotnim v testu, ter ob koncu rotenon in antimicin za določitev nemitohondrijske porabe kisika v nepoškodovanih celicah. Upoštevajte, da se reducirano barvilo ponovno oksidira s prenosom elektronov na kisik, pri čemer nastane vodikov peroksid. Zato slepi vzorec samo z barvilom, brez donorja elektronov, podceni porabo kisika v sistemu brez celic, ki se pojavi, ko je na voljo NADH ali NADPH.

Pri vodikovem peroksidu dajte prednost umerjenemu testu z Amplex UltraRed in hrenovo peroksidazo pred neselektivnimi barvili DCFDA, rezultat preverite s katalazo in preizkusite odvisnost od osvetlitve, saj je barvilo fotosenzibilizator. Raziskava možganskih mitohondrijev je ugotovila, da se je peroksidna obremenitev že pri 100 nM barvila povečala za več kot štirikrat, odstranjevanje pa se je upočasnilo; peroksid je nastajal neposredno iz reduciranega barvila brez vmesnega nastanka superoksida. Podrobnosti o izbiri sond in kontrolah osvetlitve obravnava spremljevalni članek o merjenju reaktivnih kisikovih zvrsti v poskusih z barvili, širše vprašanje, kdaj peroksid deluje kot signal in kdaj kot obremenitev, pa je obravnavano skupaj s celičnim redoks ravnotežjem in trditvami o antioksidantih.

Pri trditvah o poti preizkusite obe mesti inhibicije kompleksa III: antimicin A na mestu Qi in miksotiazol na mestu Qo, dodajte pa tudi končno preverjanje kompleksa IV s cianidom. Zgodnejša raziskava mišjih možganov je poročala o obnovi dihanja z barvilom po blokadi z rotenonom, ne pa po blokadi z antimicinom, medtem ko je poznejša raziskava treh vrst ugotovila delno obnovo pri obeh inhibitorjih in dokaze o neposredni redukciji citokroma c. Obvod obravnavajte kot skladen z novejšimi podatki, ne kot dokončno potrjen, saj koncentracija barvila, mesto delovanja inhibitorja, stanje substratov in porazdelitev barvila vplivajo na opaženo pot.

Preglednica za izbiro testov

S to preglednico izberite meritev glede na vprašanje, ne obratno.

Za minimalno prepričljivo trditev je treba pri istih koncentracijah barvila, 100 nM, 300 nM, 1 uM in 2 uM, izmeriti pretok kisika v pogojih puščanja protonov ter ob prisotnosti ADP, oligomicina in razklopnika, hitrost sinteze ATP, membranski potencial po možnosti z dvema sondama ter umerjeno sproščanje peroksida s katalazo in kontrolami brez celic. Poročajte o povezanem naboru: pretok kisika skupaj s hitrostjo nastajanja ATP, ATP na kisik, potencialom in peroksidom. Vsaka od teh številk zase je meritev, ki šele išče svoj pomen.