Enostavno barvanje z metilenskim modrilom v primerjavi z barvanjem po Gramu: kaj lahko dokaže posamezna metoda

Študent pripravi razmaz iz kulture z oznako E. coli, ga za eno minuto prelije z metilenskim modrilom, spere in pogleda skozi imerzijski objektiv. Vidno polje prekrivajo modre paličice. V laboratorijskem poročilu piše: »Gramnegativne paličice, identificirane kot E. coli.« Opažanje je pravilno. Sklep pa na podlagi tega preparata ni utemeljen.

Napaka je konceptualna, ne tehnična. Študent je enostavno barvanje obravnaval, kot da bi šlo za diferencialni preizkus. Enostavno barvanje in barvanje po Gramu odgovarjata na različni vprašanji, saj temeljita na različnih načelih barvanja. Prvo sprašuje: kakšna oblika je prisotna. Drugo sprašuje: kako se celična stena odzove na preizkus. Če ju zamenjate, lahko pravilno obarvan preparat privede do neutemeljenega poročila.

Ta primerjava jasno ločuje metodi, pokaže, katere trditve upravičuje posamezen rezultat, in odgovarja na vprašanji, ki ju študenti najpogosteje zastavljajo: ali je metilensko modrilo mogoče uporabiti pri barvanju po Gramu in kaj barvanje E. coli z metilenskim modrilom dejansko pokaže.

Kratek odgovor

Enostavno barvanje z metilenskim modrilom vse celice, ki se lahko obarvajo, obarva enako modro, zato razkrije morfologijo (paličice, krogle, spirale) in razporeditev (posamezne celice, pari, verižice), ne pove pa ničesar o razvrstitvi po Gramu. Barvanje po Gramu vključuje še jod, korak razbarvanja in kontrastno barvilo, zato bakterije razdeli na grampozitivne (vijolične) in gramnegativne (rožnate ali rdeče) glede na to, kako njihove celične ovojnice zadržujejo barvilo. Modre paličice po barvanju z metilenskim modrilom pomenijo »prisotne so paličaste celice«. Rožnate paličice po celotnem postopku barvanja po Gramu pomenijo »prisotne so gramnegativne paličice«. Druga trditev ima trdnejšo podlago, saj je postopek vključeval dodaten preizkus.

Širši sklop metod barvanja bakterij z enim barvilom, v katerega sodi ta članek, je predstavljen v atlasu barvanja za mikroskopijo.

Enostavno barvanje: eno barvilo, eno vprašanje

Metilensko modrilo je bazično (kationsko) barvilo. Njegov obarvani ion ima pozitiven naboj in se veže na negativno nabite strukture v celici, vključno z nukleinskimi kislinami in kislimi skupinami na površini, zato so celice na svetlem ozadju videti modre. OpenStax to načelo pozitivnega barvanja opisuje v poglavju o barvanju. Kation barvila je majhen, ploščat fenotiazinski ion, podrobno opisan v pregledu kemije metilenskega modrila; kloridni protiion ne povzroča obarvanja.

Standardni učni protokol je namenoma preprost: pripravite tanek razmaz, ga posušite na zraku, fiksirajte s toploto, prelijte s približno 1% vodno raztopino metilenskega modrila za približno eno minuto, nežno sperite z vodo, osušite s popivnanjem in preglejte z oljno imerzijo. Učni protokol LibreTexts navaja prav to enominutno barvanje z 1% raztopino, obenem pa omenja, da nekateri laboratoriji čas podaljšajo. Brez sredstva za vezavo barvila, brez sredstva za razbarvanje, brez drugega barvila. Prav ta odsotnost je bistvena. Ker uporabimo le eno barvilo in ga ne odstranjujemo selektivno, so vse celice, ki vežejo barvilo, na koncu enake barve.

Pri E. coli v vidnem polju pričakujemo modre paličice (bacile), posamezno, v parih ali manjših skupinah. Modra barva izvira iz barvila. Paličasta oblika je lastnost organizma. Toda ta kombinacija ne omogoča identifikacije organizma, saj so številne vrste paličaste in se številne paličice pri enostavnem barvanju obarvajo modro. ATCC v svojem vodniku za gojenje mikroorganizmov izrecno navaja to omejitev na morfologijo. Pravilno poročilo se glasi: »Opaženi so bili modri bacili.« Za vse, kar presega obliko in razporeditev, potrebujemo dodatne dokaze.

Barvanje po Gramu: štirje reagenti, en preizkus odziva

Barvanje po Gramu je diferencialno barvanje. Vse celice izpostavi enakemu zaporedju korakov, pri čemer opazujemo, katere celice zadržijo prvo barvilo in katere ga izgubijo. Protokoli Ameriškega mikrobiološkega društva za barvanje po Gramu določajo standardno zaporedje štirih korakov: kristal vijolično (primarno barvilo), Gramova jodova raztopina (sredstvo za vezavo barvila), alkohol ali mešanica acetona in alkohola (sredstvo za razbarvanje), nato safranin (kontrastno barvilo).

Standardni učni model to razliko pojasnjuje z zgradbo celične ovojnice. Grampozitivne celice imajo debelo peptidoglikansko steno, ki se med spiranjem z alkoholom dehidrira in zadrži kompleks kristal vijoličnega in joda. Gramnegativne celice imajo tanko peptidoglikansko plast in z lipidi bogato zunanjo membrano, ki jo sredstvo za razbarvanje poruši, zato se kompleks izpere, celice pa nato sprejmejo safranin. Pregled barvanja po Gramu v NCBI Bookshelf podaja to razlago na podlagi celične stene. Strokovnjaki dodajajo, da je celotna fizikalna kemija procesa bolj zapletena, kot bi sklepali zgolj iz debeline stene, vendar pri interpretaciji v laboratoriju velja pravilo odziva: vijolična pomeni, da je celica barvilo zadržala, rožnata pa, da ga je izgubila in se nato obarvala s kontrastnim barvilom.

Ponazoritvene slike. Stilizirane risbe za primerjavo metod, ne mikrofotografije, posnete s kamero. Barve so poenostavljene za prikaz načela: ena barva pri enostavnem barvanju, dve barvi po razbarvanju v postopku po Gramu.

Ali je metilensko modrilo mogoče uporabiti pri barvanju po Gramu

To vprašanje lahko razumemo na dva načina, ki zahtevata različna odgovora.

Prvi pomen: ali lahko enkratno prelitje z metilenskim modrilom nadomesti celoten postopek barvanja po Gramu. Ne. Brez joda, sredstva za razbarvanje in kontrastnega barvila ni diferencialnega koraka, zato razvrstitve po Gramu ne preverjamo. Modro vidno polje po uporabi zgolj metilenskega modrila je rezultat enostavnega barvanja, tudi če steklenička stoji ob reagentih za barvanje po Gramu. Ne zabeležite ga kot rezultat barvanja po Gramu.

Drugi pomen: ali lahko metilensko modrilo nadomesti safranin kot kontrastno barvilo v koraku 4. Po svoji funkciji lahko obarva razbarvane celice, učbeniška vaja pa po takšni zamenjavi napoveduje vijolične grampozitivne in modre gramnegativne celice. Ta sklep je utemeljen, saj so pravilno razbarvane gramnegativne celice skoraj brezbarvne in sprejmejo drugo kationsko barvilo. Vendar to ni standardni protokol. Protokoli ASM določajo uporabo safranina, v nekaterih različicah pa priznavajo alternative, kot je bazični fuksin, ne metilensko modrilo. Zamenjava ima tudi praktično slabost: modro je od vijolične težje razlikovati kot rožnato od vijolične, zlasti za začetnike in pri oslabljenih mikroskopskih svetilkah. Pri študijskem delu in pri vsakem rezultatu, ki je pomemben, uporabite kontrastno barvilo, navedeno v protokolu, običajno safranin. Metilensko modrilo kot kontrastno barvilo obravnavajte kot demonstracijsko različico, ne kot enakovreden standard.

Sorodno vprašanje, kako se metilensko modrilo primerja z drugimi možnostmi barvanja z enim barvilom, je obravnavano v primerjavi enostavnih barvanj bakterij.

Kaj barvanje E. coli z metilenskim modrilom dokaže in česa ne

E. coli je gramnegativna paličica, vendar ta poved združuje dejstva, pridobljena z več metodami: morfologijo z mikroskopijo, reakcijo po Gramu z barvanjem po Gramu, identiteto pa z gojenjem ter biokemijskimi ali molekularnimi preizkusi. Razmaz, obarvan z metilenskim modrilom, prispeva le prvi del. Pokaže, da so v obarvanem vzorcu prisotne paličaste celice in kako so razporejene. Ne določi reakcije po Gramu, saj preizkus razbarvanja ni bil izveden. Ne identificira vrste, saj so paličice številnih vrst pri tej ločljivosti videti podobno.

Prav tu se v poročilih pojavlja predvidljiva napaka. Pisec v zapis opažanja vnese predhodno znanje (»ta kultura naj bi bila E. coli, E. coli pa je gramnegativna«), zato se zdi, da preparat potrjuje nekaj, kar je bilo v resnici le predpostavljeno. Jasnejše poročilo loči posamezne ravni: »Enostavno barvanje z metilenskim modrilom: opaženi modri bacili; ugotovljena le morfologija, razvrstitev po Gramu ni bila preverjena.« Nato, če je bilo barvanje po Gramu pravilno izvedeno s kontrolami: »Barvanje po Gramu: rožnate paličice, skladno z gramnegativno reakcijo.« Identiteto vrste določimo pozneje, v postopku identifikacije, ne zgolj na podlagi barve.

Praktični vodnik za interpretacijo

Pri laboratorijskem delu uporabite to pravilo odločanja. Če so vse celice enake barve in je protokol vključeval eno barvilo brez sredstva za razbarvanje, ste izvedli enostavno barvanje. Poročajte o obliki, ocenjeni velikosti in razporeditvi. Pri tem se ustavite. Če je protokol vključeval kristal vijolično, jod, sredstvo za razbarvanje in kontrastno barvilo z znanimi pozitivnimi in negativnimi kontrolami, ste izvedli barvanje po Gramu. Poročajte o barvi in morfologiji: vijolični koki v verižicah, rožnate paličice in podobno.

Večino zmede povzročajo tri napake. Prva je pretirana interpretacija modrih paličic kot potrditve E. coli. Druga je zapis preparata, obarvanega z metilenskim modrilom, pod naslov »Barvanje po Gramu« v laboratorijskem zvezku, kar bodo poznejši bralci napačno razumeli. Tretja je nepremišljeno zamenjevanje kontrastnih barvil in nato primerjanje barv med laboratoriji, kot da bi vsi uporabljali enako barvno paleto. Vse tri napake imajo enako rešitev: poimenujte metodo, ki je bila dejansko izvedena, in trdite le tisto, kar ta metoda preverja.

Enostavno barvanje ima svoje mesto prav zato, ker omogoča le omejene trditve. Je hitro, dopušča manjše napake in zadostuje, kadar nas zanima morfologija: ali je kaj prisotno in kakšne oblike je. Kadar nas zanima razvrstitev, izvedite diferencialni preizkus. Modri preparat pove, kako so celice videti. Vijolični ali rožnati preparat pove, kako se odzivajo njihove stene. Noben od njiju sam zase ne določi vrste.