Barvanje celic lične sluznice z metilenskim modrilom: kaj opazovati

Učenka na objektno stekelce nanese kapljico suspenzije celic lične sluznice, pogleda skozi mikroskop in ne vidi skoraj ničesar. Po svetlem polju plava nekaj bledih obrisov. Izostri sliko, nato poveča osvetlitev in nazadnje sklene, da je stekelce prazno. Stekelce ni prazno. Celice so tam. So skoraj prosojne in prav prosojnost je težava, ki jo to barvanje rešuje.

To neskladje med pričakovanji in sliko je vredno izpostaviti pred začetkom postopka. Začetniki pričakujejo, da bo mikroskop razkril podrobnosti tako, kot povečava fotoaparata razkrije oddaljen napis. Mikroskop s svetlim poljem ima ožjo nalogo: prikazuje razlike v absorpciji svetlobe. Neobarvana celica lične sluznice absorbira skoraj nič svetlobe, zato skoraj ne ustvari razlike. Metilensko modrilo to razliko doda. V celici se veže neenakomerno in strukturo spremeni v kontrast. Ko učenci razumejo ta koncept, je vsak naslednji korak logična posledica, ne zgolj navodilo.

Pri tem pomaga poznavanje tega, kako preprosta barvanja povečajo kontrast v šolskem laboratoriju, ponovitev nastavitve mikroskopa s svetlim poljem pred barvanjem pa prepreči polovico neuspelih preparatov. Kemijsko ozadje barve pojasnjuje uvod v uporabo metilenskega modrila pri mikroskopiji, ki obravnava, zakaj se prav to barvilo vedno znova pojavlja na laboratorijski mizi.

Šolski protokol

Spodaj opisana različica z mokrim preparatom je preprostejša osnovna izbira za splošni pouk. Ne potrebuje plamena niti fiksacije. Različica s fiksiranim razmazom, ki jo uporabljajo nekateri visokošolski priročniki, vključuje sušenje na zraku in kratko toplotno fiksacijo, kot v vaji z razmazom lične sluznice ustanove North Central Texas College, objavljeni na Biology LibreTexts, vendar je toplotna fiksacija običajen mikrobiološki postopek, ne pogoj za opazovanje epitelijskih celic.

Potrebujete: čista objektna in krovna stekelca, sterilne brisne palčke za enkratno uporabo (prednostna izbira) ali nove ploščate zobotrebce, kapalko z 0.5- do 1-odstotno vodno raztopino metilenskega modrila, destilirano ali deionizirano vodo, pivnik, rokavice in sestavljeni svetlobni mikroskop s skupnima povečavama 100x in 400x.

1. Usta sperite z navadno vodo. S tem odstranite delce hrane, ki se pozneje močno obarvajo in odvračajo pozornost od celic.
2. Vsak učenec odvzame vzorec samo s svoje lične sluznice. Notranjo stran lica nežno podrgnite z novo sterilno brisno palčko. Pritisnite, ne strgajte. Prenehajte, še preden bi se pojavilo kakršno koli nelagodje ali krvavitev.
3. Brisno palčko povaljajte po sredini čistega objektnega stekelca, da nastane tanek sloj. Tanek sloj je najpomembnejši dejavnik za dobro preglednost preparata. Debel bel nanos se bo obarval v nepregledno modro gmoto.
4. Na razmaz dodajte eno kapljico metilenskega modrila. Pustite delovati 1 do 3 minute. V številnih visokošolskih protokolih zadostuje ena minuta; priročnik NCERT za naravoslovni laboratorij za 9. razred za začasni preparat predvideva približno 3 minute. Daljši čas ni boljši, prekomerno barvanje pa je najpogostejša napaka pri odmerjanju časa.
5. Nežno sperite z destilirano vodo ali s pivnikom odstranite odvečno barvilo skladno z lokalnim protokolom. Ozadje mora postati bledo modro, ne temno modro.
6. Krovno stekelce spustite pod kotom, tako da se najprej dotakne z enim robom, nato ga počasi položite. S tem preprečite nastanek zračnih mehurčkov.
7. Začnite pri majhni povečavi, da najdete celice, preverite ostrino in položaj v središču vidnega polja, nato preidite na 100x in nazadnje na 400x. Pri 400x uporabljajte samo vijak za fino ostrenje.

Koncentracija barvila si zasluži en natančen stavek. Šolski protokoli večinoma uporabljajo približno 1-odstotno vodno raztopino metilenskega modrila. Bolj koncentrirana osnovna raztopina ali daljša izpostavljenost hitreje potemni ozadje kot jedro, kar obrne kontrast, na katerem temelji vaja.

Varno ravnanje z vzorci lične sluznice

Vzorci lične sluznice vsebujejo slino in običajne ustne mikroorganizme, zato vsak svež razmaz obravnavajte kot potencialno kužen material, čeprav so darovalci zdravi sošolci. Smernice Ameriškega združenja za mikrobiologijo o biološki varnosti v učnih laboratorijih določajo splošna načela: pred vajo ocenite tveganje, nosite rokavice, zaščitite oči, kadar je mogoče brizganje, po delu si umijte roke, razkužite delovne površine in onesnažene pripomočke za enkratno uporabo odstranite po odobrenem postopku za biološke odpadke.

Štiri pravila pri pouku pokrijejo večino tveganj. Ena brisna palčka in eno objektno stekelce za enega darovalca; nikoli jih ne delite. Vsak vzorec odvzame samo sebi, nikoli sosedu. Brisne palčke in zobotrebci za enkratno uporabo gredo neposredno v namensko posodo za odpadke, nikoli nazaj na delovno površino. Metilensko modrilo obarva kožo in oblačila ter draži oči, zato uporabljajte rokavice in upoštevajte običajna higienska pravila za delo z barvili. Vaje ne razširjajte na gojenje česar koli iz razmaza in ne improvizirajte toplotne fiksacije svežega človeškega materiala zunaj šolskega varnostnega postopka.

Kaj opazovati in zakaj je videti tako

Pri 100x poiščite široke, ploščate, bledo modre celice z nepravilnimi ovalnimi ali mnogokotnimi obrisi. Ležijo posamično ali v rahlih, prekrivajočih se plasteh. Vsaka celica ima običajno eno temnejšo modro liso. Ta lisa je jedro. Opazujte tudi razporeditev: ploščate epitelijske celice so tanke ploščice, ne krogle, zato njihovi robovi spominjajo na razpokano glazuro in ne na okrogle balone.

Pri 400x so jasno razločljive tri značilnosti. Meja celice je videti kot tanka temnejša črta, ki obdaja celico. Citoplazma zapolnjuje notranjost s svetlo, enakomerno modro barvo. Jedro je temnejše in bolj kompaktno, pogosto ovalno, navadno blizu središča, vendar ne vedno. Učencem naročite, naj zabeležijo vse tri značilnosti ter obliko in povečavo, saj delovni list zahteva prav to.

Tu je pomembna natančnost, pri kateri se številni delovni listi motijo. Vidna meja ustreza območju plazemske membrane, vendar je sama membrana, lipidni dvosloj, debel približno 7 do 10 nanometrov, daleč pod ločljivostjo šolskega mikroskopa. Učenci vidijo optični rob celice in barvilo, nakopičeno na njem. Enaka previdnost velja za organele. Mitohondriji, endoplazemski retikulum, Golgijev aparat in ribosomi v tem preparatu niso vidni. Običajen svetlobni mikroskop v dobrih pogojih razločuje podrobnosti do približno 0.2 mikrometra, kot pojasnjuje gradivo NCBI o mikroskopskih orodjih v celični biologiji, večina ultrastrukture pa je pod to mejo ali blizu nje. Večja prazna povečava poveča sliko, ne da bi dodala podrobnosti.

Zakaj se jedro obarva najtemneje? Metilensko modrilo je kationsko barvilo, v raztopini pozitivno nabito, in se povezuje z negativno nabitimi snovmi v celici, predvsem z nukleinskimi kislinami. Kromatin zgošča DNA v jedru, zato se v jedru nabere največ barvila. Citoplazma vsebuje RNA in druge nabite molekule, zato se prav tako obarva, vendar bolj razpršeno in svetleje. Ključni zadržek: metilensko modrilo ni barvilo, specifično za DNA. Raziskava o porazdelitvi metilenskega modrila pri slikanju jeder opisuje povezovanje kationa z območji, bogatimi z nukleinskimi kislinami, starejša kvantitativna raziskava o vezavi metilenskega modrila v celičnih preparatih pa je ugotovila, da je bila večina vezanega barvila povezana z nukleinskimi kislinami. Temno jedro in svetla citoplazma sta zato vzorec kontrasta, ne molekularna analiza.

Napake, ki jih bodo učenci naredili, in kako jih prepoznati

Skoraj vsak neuspel preparat spada v enega od petih vzorcev. Učence naučite prepoznati težavo v preparatu, namesto da ga slepo ponavljajo.

Prekomerno barvanje enakomerno potemni celice in ozadje, zato se jedro izgubi v vidnem polju. Težavo odpravite s krajšim časom barvanja ali temeljitejšim spiranjem. Premalo intenzivno barvanje pusti blede obrise, ki izginejo ob močnejši osvetlitvi; čas podaljšujte v korakih po trideset sekund. Debeli razmazi ustvarijo goste, prekrivajoče se gmote, v katerih ni mogoče slediti nobenemu obrisu; popravek je mehanski: naslednjič nanesite tanjši sloj, saj nobeno spiranje ne reši kupa celic. Zračni mehurčki so videti kot popolni krogi z ostrimi temnimi robovi in odvračajo pozornost začetnikov, ki jih zamenjajo za strukture; krovno stekelce ponovno položite počasi in pod kotom. Drobne temne pike, raztresene po celicah ali okoli njih, so običajno normalne ustne bakterije, kot opozarjajo šolski protokoli, na primer postopek za opazovanje celic lične sluznice Ingrid Science. Potrjujejo, da so usta naseljena, kar si učenci morda dobro zapomnijo, vendar jih pri tej vaji ni mogoče določiti do vrste in jih ne smemo narisati kot dele celice. Ostanki hrane in sluzne nitke se obarvajo neenakomerno in intenzivno; predhodno spiranje je namenjeno njihovemu zmanjšanju.

Česa ta vaja ne more pokazati

To je opazovanje za učne namene, ne diagnostični test. Iz videza celic pri šolskem barvanju ni mogoče diagnosticirati okužbe, raka ali katere koli bolezni in članka ne smemo razumeti, kot da nakazuje drugače. Preparat pri dveh povečavah pokaže obliko, mejo, citoplazmo in jedro. Ne pokaže ultrastrukture membrane, podrobnosti organelov ali molekularne identitete. Jasno navedena omejitev varuje tako znanost kot učence: dober rezultat je pravilno označena risba z zabeleženima povečavo in barvilom, ne sklep o zdravju.

Delovni list za učence in označene mikrografije

Dve projektni gradivi za to stran sta zgornja označena mikrografija in spodnji delovni list. Natisnite po en delovni list za vsakega učenca ali ga projicirajte in učencem naročite, naj polja prekopirajo v zvezke.

Kako ga uporabiti pri 45-minutni učni uri: deset minut za varnostna navodila in odvzem vzorcev, deset minut za barvanje in pripravo preparata, petnajst minut za opazovanje in skiciranje pri obeh povečavah ter deset minut za kontrolni seznam in primerjavo z označeno mikrografijo. Postavke kontrolnega seznama so namenoma povsem konkretne. Tanek razmaz, pravilen čas barvanja, jedro temnejše od citoplazme, zabeležena povečava. Učenec, ki lahko označi vse štiri, je razumel koncept, ki ga učna ura želi posredovati: mikroskopi prikazujejo razlike, barvanja pa ustvarjajo razlike, ki jih je vredno prikazati.