ලිපිය
DNA සහ RNA වර්ණ ගැන්වීම සඳහා මෙතිලීන් බ්ලූ: ජෙල් සහ පටල යෙදීම්
ශිෂ්‍යයෙක් ඇගරෝස් ජෙල් එකක විද්‍යුත් විච්ඡේදනය සිදු කර, එය මෙතිලීන් බ්ලූවලින් වර්ණ ගන්වා, දීප්තිමත් පටියක් බලාපොරොත්තු වූ තැන කිසිවක් නොදකියි. යාබද වැඩපොළේ පශ්චාත් ආචාර්ය පර්යේෂකයෙක් එම නිල් ද්‍රාවණ බෝතලයෙන්ම Northern පටලයක් වර්ණ ගන්වා මිනිත්තු තුනකින් පැහැදිලි රයිබොසෝමීය පටි ලබා ගනියි. ශිෂ්‍යයා ජෙල් පරීක්ෂණය අසාර්ථක වූ බව නිගමනය කරයි. ජෙල් පරීක්ෂණය අසාර්ථක වූයේ නැත. කාර්යයන් දෙක වෙනස් වූ අතර, එකම වර්ණකය ඒවාට ප්‍රතිචාර දක්වන්නේ වෙනස් සංවේදීතාවකින්, වෙනස් පසුබිමකින් සහ ඉන්පසු සිදු කරන දේ සඳහා වෙනස් නීතිවලට අනුවය.
මෙතිලීන් බ්ලූ මඟින් DNA වර්ණ ගැන්වීම සහ RNA වර්ණ ගැන්වීම එකම රසායනය මත පදනම් වුවත්, ඒවායේ අරමුණු එක සමාන නොවේ. ජෙල් එකකදී වර්ණකය පෙන්වන්නේ සිදුරු සහිත මාධ්‍යය තුළ කොපමණ න්‍යෂ්ටික අම්ල ප්‍රමාණයක් තිබේද යන්නයි. පටලයක් මතදී එය පෙන්වන්නේ මාරු කිරීම සාර්ථක වූයේද සහ ධාවන මංතීරුවලට සමාන ලෙස නියැදි යොදා තිබේද යන්නයි. මෙම වෙනස පැහැදිලි වූ විට, ක්‍රියාපටිපාටි, හඳුනාගැනීමේ සීමා සහ අනුකූලතා සීමා තේරුම් ගැනීම පහසු වේ.
කෙටි පිළිතුර
මෙතිලීන් බ්ලූ යනු සමතල කැටායනික වර්ණකයකි. එය පොස්ෆේට් වෙත ඇති විද්‍යුත්ස්ථිතික ආකර්ෂණය, භෂ්ම යුගල අතරට ඇතුළු වීම සහ කුඩා වලයට සම්බන්ධ වීම යන ක්‍රමවල එකතුවක් හරහා න්‍යෂ්ටික අම්ල සමඟ සහසංයුජ නොවන, ප්‍රතිවර්තනීය ආකාරයෙන් බැඳෙයි. වැදගත් වන්නේ එම ප්‍රතිවර්තනීය බවයි. පටි වර්ණ ගන්වා දෘශ්‍ය ආලෝකයෙන් නිරීක්ෂණය කර, වාර්තාගත කළ පසු, ක්ලෝනීකරණය, දෙමුහුන්කරණය හෝ නැවත ප්‍රෝබ යෙදීම සඳහා වර්ණය ඉවත් කිරීමට හෝ පිරිසිදු කිරීමට හැකිය.
ද්විත්ව දාම DNA සහිත ඇගරෝස් ජෙල් මෙතිලීන් බ්ලූවලින් වර්ණ ගැන්වීම සඳහා සම්මත වේගවත් ක්‍රමය වන්නේ ජලයේ 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ද්‍රාවණයක් භාවිතයෙන් මිනිත්තු 15ක් පමණ වර්ණ ගන්වා, තවත් මිනිත්තු 15ක් පමණ ජලයෙන් වර්ණය ඉවත් කර, සුදු ආලෝක පෙට්ටියක නිරීක්ෂණය කිරීමයි. පටල සඳහා සම්භාව්‍ය Northern බ්ලොට් ක්‍රමය වන්නේ pH 5.2ට ආසන්න සෝඩියම් ඇසිටේට් ද්‍රාවණයක 0.02 සිට 0.04 percent වර්ණකයක් භාවිත කිරීමයි. මාරු කිරීමෙන් හා ස්ථායීව සවි කිරීමෙන් පසු මිනිත්තු කිහිපයක් වර්ණ ගන්වා, ජලයෙන් සෝදා, දෙමුහුන්කරණයට පෙර සම්පූර්ණයෙන් වර්ණය ඉවත් කරයි. සංවේදීතාව සීමිතය: හොඳ තත්ත්ව යටතේ එක් ජෙල් පටියකට නැනෝග්‍රෑම් දස ගණනක් සිට සිය ගණනක් දක්වා වන අතර, ප්‍රවේශම් සහගත මාර්ගෝපදේශ 0.5 සිට 1 microgram ලෙස දක්වයි. එය එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ් සහ SYBR වර්ණකවල සීමාවලට වඩා විශාලත්ව අනුපිළිවෙළ කිහිපයකින් ඉහළය. පටල මත තනි ප්‍රතිලේඛයක් සඳහා ප්‍රයෝජනවත් හඳුනාගැනීමේ සීමාවක් නොමැත. ඒ වර්ණකය ප්‍රධාන වශයෙන් පෙන්වන්නේ බහුල රයිබොසෝමීය RNA සහ යෙදූ සමස්ත ද්‍රව්‍ය ප්‍රමාණය නිසාය. මෙම ක්‍රම දෙකෙන් එකක් සඳහාවත් සිල්ලර වෙළඳපොළේ අලෙවි කරන අතිරේක ද්‍රාවණයක් ආදේශ නොකරන්න. වලංගුකරණය කළ ක්‍රම පදනම් වන්නේ විශ්ලේෂණ ශ්‍රේණියේ වර්ණකය, නිශ්චිත සංයුතියක් ඇති බෆර සහ RNA සම්බන්ධ වන විට RNase-රහිත හැසිරවීම මතය.
බැඳීම සිදුවන ආකාරය සහ එය නොමඟ යවන අවස්ථා
ප්‍රයෝජනවත් ආකෘතිය කොටස් තුනකින් සමන්විතය. පළමුව, ධන ආරෝපිත වළලු පද්ධතිය ඍණ ආරෝපිත පොස්ෆේට් ප්‍රධාන දාමයට ආකර්ෂණය වේ. අඩු ලවණ සාන්ද්‍රණයේදී මෙම විද්‍යුත්ස්ථිතික දායකත්වය ප්‍රමුඛ බව වර්ණාවලීක්ෂණ පර්යේෂණවලින් පෙනේ. එසේම, මෙතිලීන් බ්ලූ DNA සමඟ බැඳීම පිළිබඳ වර්ණාවලීක්ෂණ අධ්‍යයනයක සාරාංශ කර ඇති පරිදි, ආකෘතිකරණය සහ අණුක ගතික විශ්ලේෂණ මඟින් ද්විත්ව දාම DNA සඳහා භෂ්ම යුගල අතරට ඇතුළු වීම සහ කුඩා වලයට බැඳීම ස්ථායී බැඳීම් ආකාර ලෙස දක්වයි. දෙවනුව, GC සඳහා යම් ප්‍රියතාවක් ඇත. මෙතිලීන් බ්ලූ භෂ්ම යුගල අතරට ඇතුළු වීමේ ප්‍රියතා පිළිබඳ පර්යේෂණවලදී, ආකෘතිකරණයෙන් CpG සහ GpC අනුක්‍රමික පියවරවලට ප්‍රියතාවක් පෙන්වන අතර, අත්හදා බැලීම්වලින් GC බහුල ද්විත්ව දාම සමඟ වඩාත් ප්‍රිය සම්බන්ධතාවක් වාර්තා කරයි. එහෙත් AT ද්විත්ව දාම ද බැඳෙයි. සාමාන්‍ය වර්ණ ගැන්වීම අනුක්‍රමයකට විශේෂිත නොවේ. තුන්වනුව, තනි දාම DNA සහ RNA ප්‍රධාන වශයෙන් බැඳෙන්නේ විද්‍යුත්ස්ථිතික බල සහ නිරාවරණය වූ භෂ්ම හා ද්විත්ව දාම ප්‍රදේශ සමඟ සිදුවන ස්ථරගත අන්තර්ක්‍රියා මඟිනි. ඒ නිසා වර්ණ ගැන්වීමේ තීව්‍රතාව දිග, අනුක්‍රමය සහ ද්විතීයික ව්‍යුහය අනුව වෙනස් වේ.
මෙයින් ප්‍රතිඵල දෙකක් ඇති වේ. බැඳීම සහසංයුජ නොවන නිසා වර්ණකය සේදීමෙන් ඉවත් වේ. හිතාමතා ස්ථායී නොකළහොත් පොලිඇක්‍රිලමයිඩ් පටි ඉක්මනින් මැකී යයි. සාමාන්‍ය වර්ණ ගැන්වීම තාවකාලික බැවින්ම, PAGE ජෙල් සඳහා Soto සහ Draper විස්තර කරන පරිදි, වෙන් වූ ස්ථිර ස්ථායීකරණ ක්‍රමයක් ඇත. වර්ණකය ආලෝක සංවේදීකාරකයක් වන නිසා, ඔක්සිජන් ඇති විට වර්ණ ගැන්වූ DNA දිගු වේලාවක් දීප්තිමත් ආලෝකයට නිරාවරණය කිරීමෙන් ගුවානීන් ඔක්සිකරණය වී අවසානයේ දාමවල තනි-දාම කැපුම් ඇති විය හැකිය. මෙම යාන්ත්‍රණය මෙතිලීන් බ්ලූ මඟින් සංවේදී කළ ගුවානීන් ඔක්සිකරණය පිළිබඳ පර්යේෂණවල විස්තර කර ඇත. කෙටි වේලාවක් සුදු ආලෝකයෙන් නිරීක්ෂණය කිරීමෙන් සම්භාව්‍ය එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ් ක්‍රියාපටිපාටිවල හොඳින් දන්නා UV හානිය මඟහැරේ. සකස් කිරීම සඳහා DNA නැවත ලබා ගැනීමේදී එම වාසිය සැබෑය. දෘශ්‍ය ආලෝකය අඩු හානිකර වුවත්, හානිරහිත නොවේ. DNA ක්ලෝනීකරණයට යොදා ගන්නේ නම් ආලෝකයට නිරාවරණය කරන කාලය කෙටි කරන්න. මෙම අවවාදයට පදනම් වන පුළුල් ප්‍රකාශ රසායනය සඳහා මෙතිලීන් බ්ලූ ප්‍රකාශ රසායනයේ මාර්ග දෙක බලන්න. ඔක්සිකරණය වූ ආකාරය බැඳෙන නමුත් ඔක්සිහරණය වූ ආකාරය නොබැඳෙන්නේ ඇයිද යන්න පැහැදිලි කරන ඔක්සිකරණ–ඔක්සිහරණ යුගලය සහ ආරෝපණ තත්ත්ව සඳහා මෙතිලීන් බ්ලූ ව්‍යුහය සහ ගුණාංග පිළිබඳ රසායනය බලන්න.
පළමු කාර්යය: ජෙල් තුළ වර්ණ ගැන්වීම
ජෙල් වර්ණ ගැන්වීමෙන් එක් ප්‍රශ්නයකට පිළිතුරු ලැබේ: මෙම පටිය තුළ ඇසින් දැකීමට ප්‍රමාණවත් න්‍යෂ්ටික අම්ල තිබේද? ඇගරෝස් තුළ ඇති ද්විත්ව දාම DNA වඩාත් හොඳින් අධ්‍යයනය කර ඇති අවස්ථාවයි. Flores සහ සගයන්ගේ මුල් මෙතිලීන් බ්ලූ ජෙල් ක්‍රමය මඟින් 1 percent ඇගරෝස් මත 0.02 percent වේගවත් ක්‍රියාපටිපාටිය වලංගුකරණය කළ අතර, ඉන්පසු සාර්ථකව DNA නැවත ලබා ගැනීම සහ ක්ලෝනීකරණය පෙන්වා දුන්නේය. එම සැපයුම්කරුගේ ක්‍රියාපටිපාටිය IBI Scientific මෙතිලීන් බ්ලූ නිෂ්පාදන පිටුවේ ද දැක්වේ. එහි 0.04 percent පටල ක්‍රමය සහ වේගවත් ජෙල් ක්‍රමය එකට ලැයිස්තුගත කර ඇත.
ප්‍රායෝගික ක්‍රියාපටිපාටිය:
- සාමාන්‍ය පරිදි ජෙල් ධාවනය කරන්න. වෙනස් කළ ක්‍රමයක මාරු කිරීම හෝ වෙන් කිරීමේ විභේදනය වලංගුකරණය කර නොමැති නම්, විද්‍යුත් විච්ඡේදනය අතරතුර නොව ඉන්පසු වර්ණ ගන්වන්න.
- ආස්‍රැත ජලයේ 0.02 percent w/v මෙතිලීන් බ්ලූ ද්‍රාවණයක ගිල්වා, මෘදු ලෙස සොලවමින් මිනිත්තු 15ක් පමණ තබන්න.
- මාධ්‍යයේ පසුබිම් වර්ණය අඩු වී පටි පැහැදිලිව පෙනෙන තෙක්, ජලය කිහිප වරක් මාරු කරමින් මුළු කාලය මිනිත්තු 15ක් පමණ වන ලෙස වර්ණය ඉවත් කරන්න.
- සුදු ආලෝක ආලෝකකයක තබා වහාම ඡායාරූපගත කරන්න.
ඇගරෝස් සහ පොලිඇක්‍රිලමයිඩ් වෙනස් ලෙස හැසිරේ. ඇගරෝස් මාධ්‍යය තුළ වර්ණකය රඳවා ගන්නා නිසා වර්ණය ඉවත් කිරීම මන්දගාමී පියවර වේ. තුනී පොලිඇක්‍රිලමයිඩ් ජෙල් ඉක්මනින් වර්ණ ගැන්වෙන නමුත් වර්ණකය ද ඉක්මනින් නැති වේ. එය සකස් කිරීම සඳහා පටි කපා වෙන් කිරීමට උපකාරී වන නමුත් දිගුකාලීන වාර්තා සඳහා අවාසියකි. ස්ථාපිත Current Protocols ආකාරයේ PAGE ක්‍රම අනුගමනය කරමින්, නැවත නැවත ජලයෙන් සේදීම සමඟ එම 0.02 percent ක්‍රමයම භාවිතයෙන් මිනිත්තු 20 සිට 30 දක්වා කාලයකදී පොලිඇක්‍රිලමයිඩ් තුළ ඇති කෘත්‍රිම ඔලිගොනියුක්ලියෝටයිඩ හඳුනාගත හැකිය. තනුක TBE තුළ 0.0002 percentට ආසන්න ඉතා තනුක ක්‍රම, සකස් කිරීම සඳහා භාවිත කරන ඔලිගෝ වෙනුවෙන් පැය කිහිපයක් පුරා යොදා ගත් බව වාර්තා වී ඇත. එහෙත් ඒ සඳහා ඇති සාක්ෂි පදනම දුර්වලය.
DNA සහ RNA අතර වෙනස වැදගත්ය. ද්විත්ව දාම DNA වඩාත් ශක්තිමත්, ව්‍යුහගත බැඳීමක් ලබා දෙයි. RNA සහ තනි දාම DNA වර්ණ ගැන්වුණත්, එය වඩා දුර්වල සහ අඩුවෙන් පුරෝකථනය කළ හැකි වේ. ෆෝමැල්ඩිහයිඩ් ඇගරෝස් RNA ජෙල් සඳහා බොහෝ රසායනාගාර ජෙල් තුළ නිල් වර්ණ ගැන්වීම මඟහැර, මුලින් RNA පටලයකට මාරු කර එහි වර්ණ ගන්වයි. එමඟින් දුර්වල ජෙල් සංඥාව වෙනුවට වඩා පැහැදිලි පටල සංඥාවක් සහ නියැදි යෙදීමේ වාර්තාවක් ලැබේ.
දෙවන කාර්යය: පටල මත වර්ණ ගැන්වීම
පටල වර්ණ ගැන්වීමෙන් වෙනත් ප්‍රශ්නයකට පිළිතුරු ලැබේ: මාරු කිරීම සාර්ථක වූයේද සහ ධාවන මංතීරු සැසඳිය හැකිද? සම්භාව්‍ය යෙදීම වන්නේ Herrin සහ Schmidtගේ ප්‍රතිවර්තනීය Northern බ්ලොට් වර්ණ ගැන්වීමයි. මුල් ක්‍රමයේ pH 5.0හි 50 mM සෝඩියම් ඇසිටේට් තුළ 0.04 percent වර්ණකය මිනිත්තු 2 සිට 3 දක්වා යොදා, ජලයෙන් සෝදා, දෙමුහුන්කරණයට පෙර SSPE තුළ තනුක SDS භාවිතයෙන් වර්ණකය ඉවත් කළ හැකිය.
බහුලව භාවිත වන නවීන ප්‍රභේදය පහත පරිදිය:
- RNA හෝ විකෘතිකරණය කළ DNA නයිලෝන් හෝ නයිට්‍රොසෙලියුලෝස් වෙත මාරු කර, වර්ණ ගැන්වීමේදී නියැදිය නැති නොවන ලෙස UV හරස්-බැඳීම් ඇති කිරීමෙන් හෝ රත් කිරීමෙන් ස්ථායීව සවි කරන්න.
- විකල්ප නමුත් බහුලව භාවිත වන පියවරක්: පටලය 5 percent ඇසිටික් අම්ලයෙන් මිනිත්තු 15ක් පමණ තෙත් කරන්න.
- pH 5.2ට ආසන්න 0.3 සිට 0.5 M සෝඩියම් ඇසිටේට් තුළ 0.02 සිට 0.04 percent මෙතිලීන් බ්ලූ භාවිතයෙන් මිනිත්තු 5 සිට 10 දක්වා වර්ණ ගන්වන්න.
- ජලයෙන් සෝදා මිනිත්තු 5 සිට 15 දක්වා වර්ණය ඉවත් කර, වාර්තාගත කරන්න. ඉන්පසු දෙමුහුන්කරණයට පෙර ඉතිරි වර්ණකය ඉවත් කරන්න.
Northern වැඩ සඳහා ප්‍රධාන වශයෙන් භාවිත වන්නේ ධන ආරෝපිත නයිලෝන්ය. එම ඇසිටික් අම්ල සහ ඇසිටේට් ක්‍රියාපටිපාටිය සමඟ නයිට්‍රොසෙලියුලෝස් ද ක්‍රියා කරයි. රූපය භාවිත කරන්නේ මාරු කිරීම තහවුරු කිරීමට, 28S සහ 18S පටි සැසඳීමට (හෝ බැක්ටීරියා RNA සඳහා 23S සහ 16S), ලැඩර් සහ ප්‍රමිති සලකුණු කිරීමට, සහ සමස්ත RNA සාමාන්‍යකරණය සඳහා දළ වාර්තාවක් තබා ගැනීමටය. ප්‍රකාශිත Northern ක්‍රමවලදී නියැදි යෙදීම පරීක්ෂා කිරීමට වර්ණ ගැන්වූ රයිබොසෝමීය පටි ප්‍රමාණනය කරයි. සාමාන්‍යකරණය සඳහා මෙතිලීන් බ්ලූ රයිබොසෝමීය පටි භාවිත කළ කිරි විද්‍යා පර්යේෂණ ද ඊට ඇතුළත්ය. Southern පටල ද එලෙසම දෘශ්‍යමාන කළ හැකිය. එහෙත් වර්ණකය වඩාත් හොඳින් ස්ථාපිතව ඇත්තේ Northern නියැදි යෙදීම සහ මාරු කිරීම පරීක්ෂා කිරීම සඳහාය. Southern DNA මාරු කිරීමට පෙර විකෘතිකරණය කරන බැවින් ජෙල් සංවේදීතා අගයන් එයට එලෙසම අදාළ නොවේ.
හඳුනාගැනීමේ සීමා සහ පසුබිම: නිල් වර්ණකය පසුබසින තැන්
පහත සැසඳීම හිතාමතාම ආසන්න අගයන් ලෙස දක්වා ඇත. වර්ණකයේ කාර්යසාධනය ජෙල් ප්‍රතිශතය, පටියේ පළල, ප්‍රකාශ උපකරණ සහ වර්ණය ඉවත් කිරීමේ ක්‍රමය නිසි ලෙස පිළිපැදීම මත රඳා පවතී. එක් එක් අගය නිශ්චිත පිරිවිතරයක් ලෙස නොව විශාලත්ව අනුපිළිවෙළක් ලෙස සලකන්න.
| වර්ණකය සහ ආකාරය | එක් පටියකට ආසන්න හඳුනාගැනීමේ සීමාව | අර්ථකථනය |
|---|---|---|
| මෙතිලීන් බ්ලූ, ඇගරෝස් තුළ dsDNA | ප්‍රශස්ත තත්ත්ව යටතේ 40 සිට 250 ng; ප්‍රවේශම් සහගත අගය 0.5 සිට 1 microgram | සකස් කිරීම සඳහා යොදන නියැදි ප්‍රමාණ සහ ඉගැන්වීමේ ජෙල් සඳහා ප්‍රමාණවත්ය. ඉතා සුළු ප්‍රමාණයේ පටි සඳහා දුර්වලය. |
| මෙතිලීන් බ්ලූ, PAGE තුළ කෙටි ssDNA හෝ RNA හෝ ඔලිගෝ | දළ වශයෙන් 0.1 සිට 0.5 microgram | දිග සහ ව්‍යුහය මත රඳා පවතී. පොදු සීමාවක් නැත. |
| එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ්, dsDNA ඇගරෝස් | 1 සිට 10 ng පමණ | Flores සැසඳීමේදී ප්‍රශස්ත නිල් වර්ණ ගැන්වීමට වඩා දළ වශයෙන් සිව් ගුණයක් සංවේදීය. UV අවශ්‍යය. |
| SYBR Green I, dsDNA | 60 pg පමණ | ප්‍රතිදීප්ත රූපකරණය අවශ්‍යය. |
| SYBR Gold, DNA සහ RNA | 25 pg පමණ | ආකාර කිහිපයකදී එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ්වලට වඩා දස ගුණයකටත් වැඩි සංවේදීතාවක් ඇත. |
| රිදී වර්ණ ගැන්වීම, PAGE න්‍යෂ්ටික අම්ල | 0.3 සිට 0.9 ng පමණ; ප්‍රශස්ත කළ නිල් වර්ණ ගැන්වීමෙන් පසු රිදී වර්ණ ගැන්වීමේ අනුපිළිවෙළක 100 pg RNA වාර්තා වී ඇත | ඉතා සංවේදී නමුත් රසායනික ක්‍රියාපටිපාටිය සංකීර්ණය; නැවත ලබා ගැනීම සඳහා නුසුදුසුය. |
| ටොලුයිඩීන් බ්ලූ, PAGE RNA සහ ඔලිගෝ | ප්‍රායෝගිකව භාවිත වන ප්‍රමාණ ng සිය ගණනකි; 250 ng පමණ ලේඛනගත වී ඇත | මෙතිලීන් බ්ලූ මෙන් දෘශ්‍ය ආලෝකය භාවිත කරයි. එහෙත් SYBR පිරිවිතරවලට සැසඳිය හැකි සම්මත සීමාවක් නැත. |
සීමිත සංඥාව භාවිත කළ හැකිද යන්න තීරණය කරන්නේ පසුබිම් පාලනයයි. නිදහස් වර්ණකය තද පැහැයක් දරන නිසා, ප්‍රතිවිරුද්ධතාව ලැබෙන්නේ බැඳුණු වර්ණකය ඉවත් නොකර නොබැඳුණු වර්ණකය ඉවත් කිරීමෙනි. වඩා සාන්ද්‍ර වර්ණකයක් සංවේදීතාව වැඩි කරන්නේ කලාතුරකිනි. එය ප්‍රධාන වශයෙන් වැඩි කරන්නේ වර්ණය ඉවත් කිරීමට ගතවන කාලයයි. ඔබ භාවිත කරන නිශ්චිත ජෙල්, පටල සහ කැමරාව මත තනුකකරණ මාලාවක් පරීක්ෂා කර, සමෝධානිත ඝනත්වය යෙදූ ප්‍රමාණයට සමානුපාතිකව පවතින පරාසය පමණක් භාවිත කරන්න. මෙතිලීන් බ්ලූ නියැදි යෙදීමේ අර්ධ-ප්‍රමාණාත්මක සාමාන්‍යකරණයට සහාය වේ. එහෙත් පටලයේ ධාරිතාව, මාරු කිරීමේ කාර්යක්ෂමතාව, සන්තෘප්තිය සහ වර්ණය ඉවත් වීම මංතීරුවෙන් මංතීරුවට වෙනස් වන බැවින් එය පුළුල් ගතික පරාසයක් ඇති ප්‍රමාණාත්මක පරීක්ෂණයක් නොවේ.
අනුකූලතා සීමා: වර්ණ ගැන්වීමෙන් පසු භාවිත කළ හැකි දේ
නිල් වර්ණ ගැන්වීමෙන් පසු ක්ලෝනීකරණය කළ හැකි බව පෙන්වා දී ඇත. Flores සහ සගයන් වර්ණ ගැන්වූ ඇගරෝස් පටි කපා වෙන් කර, DNA නැවත ලබාගෙන, එය ලිගේෂණය කර සෛලවලට ඇතුළු කළහ. UV සමඟ එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ් භාවිත කිරීමෙන් පසු ලැබුණු ප්‍රතිඵලවලට වඩා හොඳ ක්ලෝනීකරණයක් ඔවුන් වාර්තා කළහ. ඊට හේතුව විය හැක්කේ අඩු ආලෝක හානිය මිස වර්ණකයෙන්ම ලැබෙන වාසියක් නොවේ. සුදු ආලෝකයට නිරාවරණය කරන කාලය කෙටි කර, නැවත ලබාගත් DNA සාමාන්‍ය ජෙල් නිස්සාරණ පිරිසිදු කිරීමකට ලක් කරන්න.
PCR සහ අනුක්‍රමණය සඳහා සාක්ෂි වඩා සීමිතය. ඉතිරි වර්ණකය න්‍යෂ්ටික අම්ල සමඟ බැඳෙන බැවින්, එන්සයිම පියවරවලට පෙර වර්ණය ඉවත් කර පිරිසිදු කරන්න. නිල් ජෙල් එකකින් නිසි ලෙස පිරිසිදු කළ DNA ක්‍රියා කරනු ඇතැයි අපේක්ෂා කළත්, සෘජුවම ඉතිරි වී ගෙන යන වර්ණකයට විවිධ පොලිමරේස් සහ අනුක්‍රමණ රසායනවල ඉවසීම හොඳින් ප්‍රමාණනය කර නැත. එය එසේ යැයි උපකල්පනය නොකරන්න.
අනුපිළිවෙළ දැඩිව පිළිපදින විට බ්ලොට් දෙමුහුන්කරණය අනුකූලය: මාරු කිරීම, ස්ථායීව සවි කිරීම, වර්ණ ගැන්වීම, වාර්තාගත කිරීම, වර්ණය ඉවත් කිරීම, දෙමුහුන්කරණය. එම අනුපිළිවෙළ Herrin සහ Schmidtගේ සැලසුමයි. මාරු කිරීමට පෙර වර්ණ ගැන්වීම හෝ වර්ණය ඉවත් කිරීම මඟහැරීම වෙනත් ක්‍රමයක් වන අතර, එයට වෙන් වූ වලංගුකරණයක් අවශ්‍යය. වර්ණකය ඉවත් කළ පසු සම්මත ප්‍රෝබ ඉවත් කිරීම සහ නැවත ප්‍රෝබ යෙදීම සාමාන්‍ය පරිදි සිදු වේ. එම වර්ණක පවුලෙන්ම සෛල මට්ටමේ වර්ණ ගැන්වීම සහ ස්ථායී කළ තුනී පටලවල ක්‍රමවේදය සජීවී සෛල ක්‍රමවලට අදාළ නොවන්නේ ඇයිද යන්න සඳහා අන්වීක්ෂීය වර්ණ ගැන්වීමේ සිතියම් සංග්‍රහය බලන්න.
ස්ථිර ස්ථායීකරණ ක්‍රමය භාවිත නොකරන්නේ නම්, සකස් කිරීම සඳහා භාවිත කරන ඇගරෝස්වල සහ නිල් වර්ණයෙන් ස්ථාන හඳුනාගත් PAGE ඔලිගෝවල පටි කපා වෙන් කිරීම ක්‍රියා කරයි. ප්‍රතිවර්තනීයව බැඳෙන ද්‍රව්‍යයක් සඳහා, වර්ණය ඉවත් කිරීමෙන් පසු විද්‍යුත් නිස්සාරණය රසායනිකව සාධාරණ ක්‍රමයකි. එහෙත් මෙතිලීන් බ්ලූ සඳහාම විශේෂිත වූ පාලිත ප්‍රතිලාභ දත්ත අල්පය. නිස්සාරණයෙන් පසු ලවණ ඉවත් කරන්න හෝ අවක්ෂේපණය කරන්න.
නැවත නැවත සිදුවන අසාර්ථකතා
දුර්වල ජෙල් පටි සාමාන්‍යයෙන් පෙන්වන්නේ වර්ණමිතීය වර්ණකයකින් හඳුනාගැනීමට ප්‍රමාණවත් ස්කන්ධයක් නොමැති බවයි. විශේෂයෙන් කෙටි තනි දාම හෝ RNA ඉලක්ක සඳහා මෙය අදාළය. වැඩි නියැදි ප්‍රමාණයක් යොදන්න, අලුත් වර්ණක ද්‍රාවණයක් භාවිත කරන්න, සාන්ද්‍රණය වැඩි කිරීමට පෙර වර්ණ ගැන්වීමේ කාලය දිගු කරන්න, සහ වර්ණය ඉවත් කිරීම කලින් නවත්වන්න. ප්‍රතිවිරුද්ධතාවක් නැති සම්පූර්ණයෙන්ම නිල් වූ ජෙල් එකක් සාමාන්‍යයෙන් පෙන්වන්නේ අධික වර්ණ ගැන්වීම හෝ ජලය ප්‍රමාණවත් වාර ගණනක් මාරු නොකිරීමයි. PAGE පටි මැකී යාම අපේක්ෂිත රසායනික හැසිරීමකි; එය අසාර්ථක වර්ණ ගැන්වීමක් නොවේ. ඉක්මනින් ඡායාරූපගත කරන්න. පටලයේ අසමාන පසුබිම නැමීම්, බුබුළු, ඇඟිලි සලකුණු, අසමාන සෙලවීම හෝ තැනින් තැන අසමාන මාරු වීම පෙන්වයි. දෙමුහුන්කරණ පාලකයක් නොමැතිව එය අසමාන නියැදි යෙදීමක් ලෙස අර්ථකථනය නොකරන්න. පැතිරුණු, දුර්වල රයිබොසෝමීය රටාවක් බිඳවැටීම පෙන්නුම් කළ හැකි නමුත්, අසම්පූර්ණ මාරු කිරීම, සමස්ත RNA ප්‍රමාණය ඉතා අඩු වීම (සාමාන්‍ය මංතීරුවල මයික්‍රෝග්‍රෑම් කිහිපයක් සිට දස ගණනක් දක්වා ඇත), හෝ අධික වර්ණ ඉවත් කිරීම ද ඊට හේතු විය හැකිය. වර්ණකය පෙන්වන්නේ බහුල රයිබොසෝමීය RNA ය. එය විශේෂිත ප්‍රතිලේඛයක් නොපෙන්වයි. එම කාර්යය ප්‍රෝබයට අයත්ය.
අතිශයෝක්ති නොමැති ආරක්ෂාව සහ හැසිරවීම
මෙතිලීන් බ්ලූ එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ්වලට වඩා හැසිරවීමට සරල වුවත්, එය හානිරහිත නොවේ. වත්මන් MilliporeSigma ආරක්ෂණ දත්ත පත්‍රිකාවක් වර්ණකය උග්‍ර මුඛ විෂතාවේ Category 4 ලෙස වර්ගීකරණය කරයි. එය ගිල දැමුවහොත් හානිකර වන අතර, Sigma-Aldrich මෙතිලීන් බ්ලූ SDS අනුව අනුමත අපද්‍රව්‍ය බැහැර කිරීමේ මාර්ගයකින් බැහැර කළ යුතුය. එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ් සඳහා වඩා දැඩි ජාන විෂතා අනතුරු ඇඟවීම් ඇත. එහි Sigma-Aldrich එතිඩියම් බ්‍රෝමයිඩ් SDS තුළ ජනක සෛලවලට ඇති විය හැකි බවට සැක කරන බලපෑම් ද ඇතුළත්ය. Thermo Fisher න්‍යෂ්ටික අම්ල වර්ණක මාර්ගෝපදේශයේ සඳහන් පරිදි, එහි ජෙල් සහ ද්‍රාවණ සාමාන්‍යයෙන් අන්තරායකර රසායනික අපද්‍රව්‍ය ලෙස වෙන් කරයි. දෙකම සඳහා SDS සහ ආයතනික නීති අනුගමනය කරන්න. වියළි වර්ණකය හොඳින් වසා වියළිව තබන්න, භාවිත ද්‍රාවණය නැවත භාවිත කරන්නෙත් ක්‍රියාපටිපාටියෙන් අවසර දෙන පරිදි පමණි. වර්ණ ගැන්වූ පටල පෙරහන් පත්‍ර අතර වියළිව ගබඩා කරන්න. පටි විසරණයෙන් මැකී යාමට පෙර ජෙල් ඡායාරූපගත කරන්න.
රසායනාගාර වැඩමේසයේදී මතක තබාගත යුතු වාක්‍යය මෙයයි. ජෙල් මඟින් සුදු ආලෝකය යටතේ වැඩි නියැදි ප්‍රමාණයක දෘශ්‍යතාව පරීක්ෂා කරයි. ප්‍රෝබය සංවේදී කාර්යය කිරීමට පෙර පටල මඟින් මාරු කිරීම සහ නියැදි යෙදීම පරීක්ෂා කරයි. සීමිත සංවේදීතාව, ප්‍රතිවර්තනීය බැඳීම සහ දැඩි ක්‍රියා අනුපිළිවෙළක් සමඟ එක් වර්ණකයක් කාර්යයන් දෙකටම සේවය කරයි.