آرٽيڪل
زيبرافش جي تحقيق ۾ ميٿيلين بلو: پالنا ۾ شامل ٿيندڙ مادو ۽ تجربن کي متاثر ڪندڙ عامل
زيبرافش جي آنن جو پاڻي اڪثر هلڪو نيرو هوندو آهي، ۽ شايد ئي ڪو ان جو سبب لکي ٿو. اهو رنگ ميٿيلين بلو آهي، جيڪو فنگس خلاف شامل ڪيو ويندو آهي، ۽ اڪثر پروٽوڪول ان کي پسمنظر جو حصو سمجهن ٿا. هتي پسمنظر وارو تصور درست ناهي. وڌيڪ مناسب تصور هڪ اهڙو تجرباتي عامل آهي جيڪو فهرست ۾ درج ناهي: اهڙو مادو جيڪو علاج ڪيل ٿانون ۾ موجود هجي پر ڪنٽرولن ۾ نه هجي، استعمال ٿيندڙ ڪنسنٽريشنن تي فارماڪولوجي طور فعال هجي، ۽ انهن ئي ماپي ويندڙ نتيجن کي بدلائي سگهي جن کي تجربو ماپي ٿو.
هي فرق هيٺ ڏنل سموري بحث جو بنياد آهي. فنگس روڪڻ لاءِ معمول جي پالنا هڪ سوال آهي. اهو اضافي مادو توهان جي جاچ جي لحاظ کان غيرجانبدار آهي يا نه، اهو هڪ الڳ سوال آهي. زيبرافش بابت تازو تحقيقي ادب پهرئين سوال جو تسلي بخش جواب ڏئي ٿو، پر ٻئي جو جواب ڳڻتي پيدا ڪري ٿو.
رهنما هدايتون اصل ۾ ڇا مقرر ڪن ٿيون
ڪو هڪ گڏيل معيار ناهي، ۽ اهو به مسئلي جو حصو آهي. Canadian Council on Animal Care جون هدايتون فنگس جي واڌ گهٽائڻ لاءِ آنن ۽ لارون جي منتقلي واري محلول ۾ 0.5 mg/L، يا 0.00005%، جي اجازت ڏين ٿيون. يورپي ليبارٽري جانورن جون هدايتون ٻڌائين ٿيون ته جنين اهڙي ميڊيم ۾ رکيا ويندا آهن جنهن ۾ اڪثر ساڳيو 0.00005% هوندو آهي. Cold Spring Harbor جو E3 نسخو ان کان ٻيڻو، 1 mg/L يا 0.0001%، نسخي جي هڪ جزو طور مقرر ڪري ٿو. ان جي مقابلي ۾ هڪ نمايان غيرموجودگي آهي: OECD جي مڇيءَ جي جنين تي زهريلي اثرن جي جاچ واري هدايت ۾ ٻيهر تيار ڪيل تخفيف وارو پاڻي ۽ جاچ هيٺ ڪيميائي مادو مقرر ٿيل آهن، پر نه ان جي 2013 واري نسخي ۾ ۽ نه ئي پوءِ واري ترميم ۾ ميٿيلين بلو جي سفارش آهي. تنهن ڪري هڪ ليبارٽري ميٿيلين بلو سان زيبرافش جي جنينن کي زندگيءَ جي پهرين ڪلاڪن کان نيري پاڻي ۾ پالي ٿي، ٻي ضابطن موجب جنيني جاچ صاف پاڻي ۾ هلائي ٿي، ۽ ٻئي پنهنجي ميڊيم کي معمولي سڏين ٿيون. جيڪو به ليبارٽرين جي نتيجن جي ڀيٽ ڪري ٿو، يا اڳوڻن ڪنٽرولن جي ڊيٽا گڏ ڪري ٿو، ان کي اها اڻهڪجهڙائي به ورثي ۾ ملي ٿي.
ڪنسنٽريشنن جي حوالي سان، 0.00005% لڳ ڀڳ 1.56 micromolar ۽ 0.0001% لڳ ڀڳ 3.13 micromolar آهي. اهي گهٽ انگ آهن، ۽ کين ايترو گهٽ سمجهڻ جو رجحان ٿي سگهي ٿو جو انهن جو ڪو فرق ئي نه پوي. هيٺ ڏنل اڀياس بلڪل ان ئي مفروضي کي، بلڪل انهن ئي ڪنسنٽريشنن تي، جاچين ٿا.
جيڪي پڙهندڙ ليبارٽري بدران مڇيون پالڻ جي حوالي سان اچن ٿا، اهي ساڳئي ماليڪيول سان هڪ مختلف ماحول ۾ ملن ٿا، جنهن تي ميٿيلين بلو بابت ايڪويريم جي رهنمائي ۾ بحث ٿيل آهي. ڪيميا ساڳي آهي؛ رنگ خلين اندر اليڪٽران ڪيئن منتقل ڪري ٿو، ان جي وضاحت ٻڌائي ٿي ته ريڊوڪس-فعال مرڪب ميٽابولزم بابت تحقيقي مقالن ۾ بار بار ڇو ظاهر ٿئي ٿو. هيٺ ڏنل بحث خاص طور ميٿيلين بلو واري زيبرافش جي آنن جي پاڻي بابت آهي.
ميٽابولزم: مرحلي سان اثر جو رخ بدلجي ٿو
سڀ کان وڌيڪ ڄاڻ ڏيندڙ اڀياس ۾ معمول موجب نشونما ڪندڙ زيبرافش کي زندگيءَ جي پهرين ڏينهن کان ڀاڻجڻ کان پوءِ 5 ڏينهن تائين ميٿيلين بلو سان سامهون رکيو ويو ۽ هر مرحلي تي آڪسيڊيٽو ميٽابولزم ماپيو ويو، جيئن جنيني ميٽابولزم جي تجربن جي ڇپيل رپورٽ بيان ڪري ٿي. هن نموني کي ڌيان سان بيان ڪرڻ ضروري آهي، ڇاڪاڻ ته ان جو رخ ابتو ٿي وڃي ٿو.
ڀاڻجڻ کان پوءِ 1 ڏينهن تي، ميٿيلين بلو سان سامهون رکيل جنينن ۾ پالنا جي ٻنهي ڪنسنٽريشنن تي بنيادي آڪسيجن جو استعمال وڌيو. 2 ڏينهن تي، لارون جي مٿاڇري واري تهه ۾ مائٽوڪانڊريا جي جھليءَ جو برقي پوٽينشل 0.00005%، 0.0001% ۽ 0.0003% تي وڌيل هو. 4 کان 5 ڏينهن تائين، آنن مان نڪرڻ کان پوءِ، اثر جو رخ بدلجي چڪو هو: آڪسيڊيٽو توانائيءَ جو خرچ گهٽيو، ڀلي سامهون رکڻ ڀاڻجڻ کان لڳاتار جاري رهيو هجي يا رڳو ڏينهن 3 کان ڏينهن 4 تائين مختصر نموني ٿيو هجي. ان سان گڏ، مائٽوڪانڊريا جي تنفسي ڪمپليڪسن جي ذيلي حصن جا ٽرانسڪرپٽ 1 ۽ 4 ڏينهن ٻنهي تي گهٽيا، ۽ اسٽيرائيڊ ٺاهڻ ۽ گلوڪوز جي نئين ٺهڻ سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽ به گهٽيا.
ٻه وڌيڪ مشاهدا تصوير کي وڌيڪ واضح ڪن ٿا. پالنا جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن تي آنن مان نڪرڻ ٿورو اڳ ٿيو؛ سامهون رکيل جنين 2 ڏينهن تي اڳتي هئا ۽ ڪنٽرول ڏينهن 3 تائين انهن جي برابر پهچي ويا. دٻاءَ جي ردعمل وارو محور پاڻ برقرار لڳو: جڏهن 5 ڏينهن جي لارون کي پاڻيءَ جي گهمڻ واري دٻاءَ هيٺ آندو ويو، ته ٻنهي گروهن ۾ سڄي جسم جو ڪارٽيسول معمول موجب وڌيو. تنهن ڪري انهن مقدارن تي اهو رنگ نشونما لاءِ ڪا عام زهر جهڙي شيءِ ناهي، ۽ اهو هر جسماني ردعمل کي دٻائي نٿو ڇڏي. اهو توانائيءَ جي ميٽابولزم کي مرحلي جي لحاظ کان بدلائي ٿو: آنن مان نڪرڻ کان اڳ مٿي ۽ پوءِ هيٺ.
رويو: ٻه اڀياس ڇو مختلف نتيجا ڏين ٿا، ۽ ٻئي ڇو درست ٿي سگهن ٿا
رويي بابت تحقيقي ادب متضاد لڳي ٿو، جيستائين ميٿيلين بلو سان سامهون رکڻ جي طريقيڪار کي گڏوگڏ نه ڏٺو وڃي. هڪ نشونما ۽ رويي جي حفاظت بابت اڀياس ۾ جنينن کي ڀاڻجڻ کان لڳ ڀڳ 6 ڪلاڪن پوءِ 10 micromolar تائين ڪنسنٽريشنن سان سامهون رکيو ويو، ڏينهن 4 تائين محلول روز نوان ڪيا ويا، پوءِ ڏينهن 5 ۽ 6 لاءِ لارون کي رنگ کان پاڪ ميڊيم ۾ منتقل ڪيو ويو ۽ ڏينهن 6 تي روشني-اوندهه واري جاچ ۾ چرپر ماپي وئي. نتيجو: موت، آنن مان نڪرڻ يا جسماني بناوت تي ڪو اهم اثر نه هو، ۽ چرپر تي به استعمال ڪيل مادي جو اثر نه هو. ليکڪن پنهنجين حالتن تحت 10 micromolar کي مٿئين حد طور معقول نموني سفارش ڪيو.
هڪ ٻئي گروهه، جنهن جا ڪجهه ليکڪ ميٽابولزم واري اڀياس ۾ به شامل هئا، ميٿيلين بلو سان سامهون رکڻ کي اهڙي نموني هلايو جيئن پالنا ۾ واقعي ٿيندو آهي: رنگ ڀاڻجڻ کان پوءِ 2 کان 3 ڪلاڪن کان موجود هو، روزانو جزوي تجديد ڪئي ويندي هئي، ۽ رويو ان وقت ماپيو ويو جڏهن سامهون رکڻ جاري هو يا تازو ختم ٿيو هو. ساڳين معمولي ڪنسنٽريشنن تي، لارون 24 ڪلاڪن واري جاچ ۾ گهٽ چرپر ڏيکاري، ۽ اهو نتيجو مختلف نسلِي لائينن ۽ ليبارٽرين ۾ ورجائي سگهيو. رويي جي نتيجن ۾ گڙٻڙ بابت اڀياس اثر جو تعلق سيروٽونن نظام جي سرگرميءَ سان ڳنڍيو، جيڪو رنگ جي ڄاتل مونوامين آڪسيڊيز روڪڻ واري خاصيت سان ٺهڪي اچي ٿو. سڀ کان وڌيڪ ٻڌائيندڙ ڳالهه اها هئي ته ميٿيلين بلو واري جنيني ميڊيم SSRI فلوآڪسيٽين جي متوقع چرپر واري ردعمل کي لڪائي ڇڏيو. تنهن ڪري نيري پاڻي ۾ هلندڙ اسڪريننگ جاچ دوا جو اهڙو اثر نظرانداز ڪري سگهي ٿي جيڪو صاف پاڻي ظاهر ڪري ها.
هتي اصل ۾ ڪو تضاد ناهي. هڪ مرڪب هڪ جاچ ۾ ڌوئي ڪڍڻ کان ٻه ڏينهن پوءِ اثر جو ڪو سڃاڻپ لائق باقي نشان نه ڇڏي سگهي ٿو، ۽ ساڳئي وقت ٻي جاچ ۾ موجود هئڻ دوران فعال رهي سگهي ٿو. عملي مطلب اهو آهي ته اثر نه ملڻ وارو نتيجو ڪنسنٽريشن جي مٿئين حد کي جائز قرار ڏئي ٿو، غيرجانبداريءَ جي دعويٰ کي نه؛ جڏهن ته اثر ملڻ وارو نتيجو ان خطري کي بيان ڪري ٿو جيڪو اهم آهي: ماپ واري عرصي دوران فعال نموني سامهون رکڻ، بلڪل انهيءَ ترتيب ۾ جيڪا اڪثر ليبارٽريون استعمال ڪن ٿيون.
ريڊوڪس جاچ اندر هڪ ريڊوڪس رنگ
هڪ ٻي ڦندي لاءِ الڳ پيراگراف ضروري آهي، ڇاڪاڻ ته اهو جانور بدران ماپ جي اوزار کي متاثر ڪري ٿو. توانائيءَ جي خرچ جي Alamar Blue جاچ پاڻ ريڊوڪس ڪيميا آهي: ريسازورِن گهٽجي فلوروسينٽ ريسوروفِن ۾ بدلجي ٿو. ميٿيلين بلو به ريڊوڪس ڪيميا آهي. خلين کان خالي ڪنٽرولن ۾، پالنا جي ٻنهي ڪنسنٽريشنن 24 ڪلاڪن کان پوءِ Alamar Blue جي فلوروسينس کي ٿورو، پر شمارياتي لحاظ کان اهم نموني، گهٽايو. جانورن وارن تجربن ۾، سامهون رکيل جنينن کي جاچ کان اڳ رنگ کان پاڪ ميڊيم ۾ گهٽ ۾ گهٽ ٽي ڀيرا ڌوتو ويو، ۽ آنن مان نڪتل لارون ۾ حياتياتي اثر خلين کان خالي حالت واري مداخلت کان وڌيڪ هو. تنهن ڪري ٻئي ڳالهيون درست آهن: ڌوتل جانورن ۾ حقيقي ميٽابولڪ اثر موجود رهي ٿو، ۽ نه ڌوتل رنگ ان مٿان سڌو ڪيميائي ماپي بگاڙ به وڌائي ٿو. ڪنٽرولن کي اهي ٻئي الڳ ڪرڻ گهرجن، نه ته ڪنهن به انگ جو ڪو مطلب نه رهندو. رنگ تي ٻڌل جاچن جا نتيجا پڙهڻ بابت عام رهنمائي هتي خاص اهميت سان لاڳو ٿئي ٿي.
نشونما جي مرحلن جي وقتوار ترتيب
هي هن مضمون لاءِ تيار ڪيل اصل مواد آهي. جيستائين ٻي ڳالهه نه ڄاڻايل هجي، ڪنسنٽريشنون پالنا جون ٻه معياري قدرون، 0.00005% ۽ 0.0001%، آهن.
| مرحلو | ڇا جاچيو ويو | پالنا جي ڪنسنٽريشنن تي نتيجو |
|---|---|---|
| 0 کان 1 dpf، آنن مان نڪرڻ کان اڳ جو جنين | بنيادي آڪسيجن جو استعمال، مائٽوڪانڊريا جا ٽرانسڪرپٽ | استعمال وڌيو؛ ڪمپليڪس I ۽ IV جا ٽرانسڪرپٽ گهٽيا |
| 2 dpf، آنن مان نڪرڻ وارو عرصو | جھليءَ جو پوٽينشل؛ آنن مان نڪرڻ جي اڳڀرائي | 0.00005% کان 0.0003% تائين پوٽينشل وڌيو؛ 0.0001% تي آنن مان نڪرڻ عارضي طور اڳتي ٿيو |
| 3 کان 4 dpf، آنن مان نڪرڻ کان پوءِ مختصر سامهون رکڻ | رڳو 24 h سامهون رکڻ کان پوءِ توانائيءَ جو خرچ | خرچ گهٽيو، لڳاتار سامهون رکڻ جهڙو نتيجو |
| 4 کان 5 dpf، آنن مان نڪتل لاروا | توانائيءَ جو خرچ؛ مائٽوڪانڊريا جا ٽرانسڪرپٽ | 24 ۽ 48 h تي خرچ گهٽيو؛ ڪمپليڪس I، II، III ۽ ATP synthase جا ٽرانسڪرپٽ گهٽيا |
| 5 کان 6 dpf، لارون جو رويو | 24 ڪلاڪن جي چرپر؛ فلوآڪسيٽين جو ردعمل | چرپر گهٽجي وئي؛ SSRI جو ردعمل لڪي ويو |
| 2 ڏينهن ڌوئي ڪڍڻ کان پوءِ 6 dpf | روشني-اوندهه ۾ چرپر؛ جسماني بناوت | 10 micromolar تائين ڪو باقي اثر نه مليو |
ياد رکڻ وارو نمونو اهو آهي ته ميٽابولڪ ماپن ۾ شروعاتي واڌ ۽ پوءِ گهٽتائي اچي ٿي؛ رويي جا اثر سامهون رکڻ دوران موجود هوندا آهن ۽ مادي جي نيڪال کان پوءِ ان هڪ جاچ ۾ سڃاڻپ لائق نه رهيا جنهن ان کي پرکيو.
ڪنٽرول جي جوڙجڪ جي چيڪ لسٽ
هي ٻيو اصل تيار ڪيل مواد آهي. جڏهن ميٿيلين بلو وارا زيبرافش پروٽوڪول ڪنهن تجربي سان گڏ استعمال ٿين، تڏهن ان کي ڪم آڻيو.
- رنگ کي پاڻي نه، پر رياجنٽ طور رپورٽ ڪريو. ڪنسنٽريشن سيڪڙو ۽ micromolar ٻنهي ۾ ڄاڻايو، ڀاڻجڻ کان پوءِ ڪلاڪن يا ڏينهن ۾ شروعات ۽ پڄاڻي، محلول جي تجديد جو شيڊول، ۽ هر ماپ کان اڳ ڌوئي ڪڍڻ جو وقفو بيان ڪريو.
- ڪنٽرولن کي سوال سان ٺهڪايو. جاچ هيٺ ڪيميائي مادي جي اڀياس لاءِ رنگ کان پاڪ ڪنٽرول گهرجن؛ پالنا جي اڀياس لاءِ رنگ کان پاڪ ۽ رنگ وارا تجرباتي گروهه گهرجن، ۽ فنگس روڪڻ جو نتيجو درج ٿيڻ گهرجي، ڇاڪاڻ ته حوالو ڏنل ٻنهي اڀياسن مان ڪنهن به فنگس روڪڻ جي اثرائتي هجڻ کي نه ماپيو.
- ريڊوڪس جاچن کان اڳ ڌوئو، پوءِ تصديق ڪريو. رنگ کان پاڪ ميڊيم ۾ گهٽ ۾ گهٽ ٽي ڀيرا ڌوئو ۽ گڏوگڏ خلين کان خالي رنگ-۽-رياجنٽ وارو ڪنٽرول هلايو، ڇاڪاڻ ته رنگ سڌو سنئون Alamar Blue جو سگنل گهٽائي ٿو.
- رويي ۽ مونوامين بابت ماپي ويندڙ نتيجن کي وڏي خطري وارا سمجهو. چرپر، ڇرڪڻ، پريشانيءَ جهڙي رويي، ضدِ افسردگي ۽ MAO روڪيندڙن جي اڀياسن ۾ ماپ دوران رنگ کان پاسو ڪرڻ گهرجي يا مخصوص ماپي ويندڙ نتيجي لاءِ ان جي غيرجانبداري ڏيکارڻ گهرجي؛ هڪ کان ٻن ڏينهن تائين ڌوئي ڪڍڻ سان چرپر جو هڪ اثر ختم ٿيو، پر ٻين تجرباتي نمونن لاءِ اهو ثابت ناهي.
- هر مرحلي تي ميٽابولڪ ۽ مائٽوڪانڊريا بابت ماپي ويندڙ نتيجن کي وڏي خطري وارا سمجهو. آڪسيجن جو استعمال، توانائيءَ جو خرچ، جھليءَ جو پوٽينشل ۽ تنفسي زنجير جا ٽرانسڪرپٽ پالنا جي ڪنسنٽريشنن تي بدلجن ٿا، ۽ آنن مان نڪرڻ کان اڳ ۽ پوءِ ابتڙ رخن ۾ بدلجن ٿا.
- هڪ تجرباتي جوڙجڪ جي غيرجانبداري ٻيءَ تي لاڳو نه ڪريو. ڌوئي ڪڍڻ کان پوءِ اثر نه ملڻ جو نتيجو جاري سامهون رکڻ تي لاڳو نٿو ٿئي؛ جسماني بناوت تي اثر نه ملڻ جو نتيجو ميٽابولزم يا دوا سان باهمي اثر تي لاڳو نٿو ٿئي؛ هڪ نسلِي لائين، گرمي پد يا جاچ جي مدت جو نتيجو ٻين تي لاڳو نٿو ٿئي.
- جيڪا رهنما هدايت توهان اختيار ڪئي، اها ۽ ان جو متبادل بيان ڪريو. CCAC، يورپي يا Cold Spring Harbor جون ڪنسنٽريشنون صاف لفظن ۾ ڄاڻايو، ۽ اهو به نوٽ ڪريو ته OECD جي جنيني جاچ ڪٿي رنگ کي شامل نٿي ڪري، ته جيئن پڙهندڙ سمجهي سگهي ته توهان جا جانور ڪهڙين حالتن ۾ هئا.
انهن ڳالهين مان ڪا به آنن کي زنده رکڻ لاءِ رنگ استعمال ڪرڻ جي مخالفت نٿي ڪري. اهي ان ڳالهه جي مخالفت ڪن ٿيون ته پالنا جي هڪ چونڊ بنا جاچ جي ڊيٽا ۾ شامل ٿي وڃي. ٿانوَ ۾ موجود نيرو رنگ هڪ اهڙو ماليڪيول آهي جنهن جي پنهنجي فارماڪولوجي آهي، ۽ جن تجربن جا نتيجا بگڙڻ جو سڀ کان وڌيڪ امڪان آهي، اهي بلڪل اهي ئي وڏي پيماني واريون ميٽابولڪ ۽ عصبي-رويي جون اسڪريننگ جاچون آهن جن لاءِ هاڻي ننڍي عمر واريون زيبرافش ترجيح ڏنيون وڃن ٿيون. ان کي درج ڪريو، ان لاءِ ڪنٽرول رکو، ماپ کان اڳ ان کي ڌوئي ڪڍو، ۽ ان جاچ کي پرکيو جنهن ۾ اهو شايد خاموشيءَ سان حصو وٺي رهيو هجي.