ميٿيلين بلو جي تجربن ۾ ردعمل ڪندڙ آڪسيجن جي صورتن جي ماپ

ٻه ليبارٽريون اهڙو تجربو ڪن ٿيون، جنهن کي هر هڪ ميٿيلين بلو جو اينٽي آڪسيڊنٽ تجربو سڏي ٿي. هڪ رپورٽ ڪري ٿي ته رنگ ردعمل ڪندڙ آڪسيجن جي صورتن کي گهٽائي ٿو. ٻي رپورٽ ڪري ٿي ته اهو انهن کي پيدا ڪري ٿو. ٻئي مقدار ۽ ردعمل جا صاف وکر ڏيکارين ٿيون. ٻئي سچي نيت سان ڪم ڪن ٿيون. فرق نه دوکي جو آهي، نه نااهليءَ جو. ڳالهه اها آهي ته ٻنهي گروهن مختلف روشنيءَ هيٺ مختلف شيون ماپيون، اهڙن پروبن سان جيڪي مختلف سوالن جا جواب ڏين ٿا، ۽ پوءِ ٻنهي جوابن کي هڪ ئي لفظ سان بيان ڪيو: ROS.

ميٿيلين بلو جي صحيح ماپ ڪرڻ ڏکيو آهي، ڇو ته اهو ان ڪيميائي عمل ۾ پاڻ حصو وٺي ٿو، جنهن جو مشاهدو ڪرڻو هوندو آهي. اونداهيءَ ۾ اهو اليڪٽرانن کي ڏيندڙن ۽ قبول ڪندڙن جي وچ ۾ منتقل ڪري، پنهنجي شروعاتي صورت ڏانهن موٽي ٿو ۽ وري چڪر هلائڻ لاءِ تيار ٿي وڃي ٿو. روشنيءَ هيٺ اهو فوٽو سينسٽائزر بڻجي، هڪ اتساهيل ٽرپليٽ حالت تائين پهچي ٿو. ان حالت مان اهو آڪسيجن کي توانائي ڏئي سنگليٽ آڪسيجن ٺاهي سگهي ٿو يا اليڪٽران منتقل ڪري ريڊيڪل ۽ هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ ٺاهي سگهي ٿو. ان نظام ۾ وڌل ڪنهن به پروب کي رنگ پاڻ آڪسائيڊ يا ريڊيوس ڪري سگهي ٿو، ان جو رنگ ڦڪو ڪري سگهي ٿو يا ان کي نوري طور لڪائي سگهي ٿو. تنهنڪري ڪنهن به ROS پڙهت بابت پهريون سوال ڪڏهن به اهو ناهي ته انگ ڪيترو آهي. سوال اهو آهي ته جاچ حقيقت ۾ ڇا ڳولي ٿي، ۽ رنگ ان جاچ سان ڇا ڪري ٿو.

Amplex Red: هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ جي ڪئليبريٽ ٿيل جاچ

ميٿيلين بلو ۽ Amplex Red جو ميلاپ هن تحقيقي ادب ۾ سڀ کان وڌيڪ قابلِ دفاع جوڙ آهي، جڏهن ان کي صحيح نموني ترتيب ڏنو وڃي. ان جي ڪيميا مخصوص آهي: هارس ريڊش پيرو آڪسيڊيز، هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ استعمال ڪري Amplex سبسٽريٽ کي هڪ فلوريسنٽ پيداوار، ريسوروفن، ۾ آڪسائيڊ ڪري ٿو، تقريباً هڪ جي مقابلي ۾ هڪ جي اسٽوڪيوميٽري سان. نموني جو پيرو آڪسائيڊ ڊٽيڪٽر ۾ فلوريسنس بڻجي وڃي ٿو. روايتي ROS خاندان جي ڪا ٻي صورت سڌو سنئون اهو ردعمل نٿي هلائي.

فيصلائتو فائدو ڪئليبريشن آهي. هڪ محتاط محقق پيرو آڪسائيڊ جا ڄاتل معياري نمونا ساڳئي بفر ۾، پيرو آڪسيڊيز ۽ سبسٽريٽ جي ساڳين ڪنسنٽريشنن، ساڳئي انڪيوبيشن وقت ۽ ساڳين نوري سيٽنگن سان هلائي ٿو، پوءِ نمونن جون پڙهتون ان وکر سان ڀيٽي ٿو. دماغ مان الڳ ڪيل مائيٽوڪانڊريا واري مطالعي ۾، جيڪو هن طريقي جو بنياد آهي، ليکڪن بلڪل ائين ڪيو: هر رن جي پڇاڙيءَ ۾ پيرو آڪسائيڊ جون ڄاتل مقدارون وڌيون، ۽ انگن کي من ماني فلوريسنس يونٽن بدران پروٽين جي هر ملي گرام لاءِ في منٽ پيڪومولن جي شرحن طور رپورٽ ڪيو. اهو ئي چمڪ کي ماپ ۾ بدلائي ٿو.

ان مطالعي جا ٽي تفصيل نقل ڪرڻ جهڙا آهن. پهريون، ليکڪن ڪيٽيليز سان سگنل جي تصديق ڪئي، جيڪو پيرو آڪسائيڊ کي ختم ڪري ٿو. ميٿيلين بلو سبب فلوريسنس ۾ ٿيندڙ واڌ، ڪيٽيليز وڌڻ تي رڪجي وئي؛ ان سان تصديق ٿي ته سگنل پيرو آڪسائيڊ جو هو، نه ڪو نوري مصنوعي اثر. ٻيو، هنن اتساهيندڙ شعاع تي شٽر لڳائي روشنيءَ کي سڌي طرح آزمائيو، جيئن نمونن کي عام روشنيءَ جي مقدار جو اٺون حصو ملي، ۽ سگنل رڳو نو سيڪڙو گهٽيو. سندن رپورٽ ڪيل پيرو آڪسائيڊ جو نوي سيڪڙو کان وڌيڪ حصو ماپ واري روشنيءَ کان آزاد هو. ٽيون، هنن اليڪٽروڊ سان پيرو آڪسائيڊ جي خاتمي کي الڳ ماپيو ۽ ڏٺو ته رنگ پيداوار وڌائي به ٿو ۽ صاف ٿيڻ کي سست به ڪري ٿو. رڳو خالص فلوريسنس رپورٽ ڪندڙ پروب انهن ٻن اثرن کي گڏائي ڇڏي ها.

ان هوندي به جاچ ۾ ناڪاميءَ جا امڪان آهن، ۽ ميٿيلين بلو انهن مان ڪيترن کي ظاهر ڪري ٿو. رنگ ساڳئي ڳاڙهي نوري خطي ۾ وڏي حد تائين روشني جذب ڪري ٿو، جتي ريسوروفن روشني خارج ڪري ٿو؛ تنهنڪري رنگ جي وڌيڪ ڪنسنٽريشن تي نمونو اندروني فلٽر اثرن وسيلي پنهنجو سگنل پاڻ لڪائي سگهي ٿو. ان ڪري معياري نمونن ۾ رنگ جي ڪنسنٽريشن، آزمائشي نمونن جي برابر هجڻ گهرجي. Amplex Red پاڻ به روشنيءَ سبب آڪسائيڊ ٿي سگهي ٿو، ۽ ان جي پيداوار ريسوروفن فوٽو ريڊاڪس چڪر ۾ داخل ٿي سپر آڪسائيڊ ۽ پيرو آڪسائيڊ پيدا ڪري سگهي ٿي. اهو تڏهن تمام اهم آهي، جڏهن تجربو فوٽو سينسٽائزر تي به روشني وجهي ٿو. عملي حل اهو آهي ته پهرين ميٿيلين بلو جي نمونن تي شعاع وڌا وڃن، پوءِ انهن جي ورتل حصن کي اونداهيءَ ۾ Amplex ريجنٽن سان جاچيو وڃي، بدران ان جي ته رنگ ۽ پروب کي گڏ روشن ڪيو وڃي. آخر ۾، سپر آڪسائيڊ ڊسميوٽيز رڳو Amplex سگنل کي گهٽ نٿو ڪري: سپر آڪسائيڊ کي پيرو آڪسائيڊ ۾ بدلائڻ سان سگنل وڌي سگهي ٿو. اهڙو SOD ڪنٽرول، جيڪو فلوريسنس وڌائي، ناڪام نه ٿيو آهي. ان سپر آڪسائيڊ کي عمل جي اڳئين مرحلي واري صورت طور سڃاتو آهي.

DCFDA: آڪسائيڊيشن جو غير مخصوص اشارو

ميٿيلين بلو ۽ DCFDA جو جوڙ گهڻي مونجهاري جو ذريعو آهي. DCFH-DA سيل ۾ داخل ڪرڻ لاءِ استعمال ٿيندڙ هڪ اڳواٽ مرڪب آهي. سيل اندر ايسٽريز ان جا ايسيٽيٽ گروپ هٽائين ٿا، جنهن سان غير فلوريسنٽ DCFH بچي ٿو، ۽ DCFH جي آڪسائيڊيشن مان فلوريسنٽ DCF ٺهي ٿو. ان کي آڪسائيڊ ڪندڙ شين جي فهرست ڊگهي آهي: هائيڊروڪسيل ريڊيڪل، پيرو آڪسيڊيز ۽ هيم جا وچولي مرڪب، نائٽروجن ڊاءِ آڪسائيڊ، هائيپوڪلورس تيزاب، ۽ پيرو آڪسي نائٽرائيٽ مان نڪتل ريڊيڪل. هائيڊروجن پيرو آڪسائيڊ اڪيلو ان کي ڪنهن ڪارائتي شرح تي سڌو آڪسائيڊ نٿو ڪري؛ پيرو آڪسائيڊ تي دارومدار رکندڙ فلوريسنس لاءِ عام طور عمل ۾ لوهه، هيم پروٽينن يا پيرو آڪسيڊيز جي ڪيميا گهربل هوندي آهي.

اهو تنقيدي جائزو، جنهن جو حوالو هر طريقن واري حصي ۾ هجڻ گهرجي، ڪليانارامن ۽ ساٿين جي DCFH کي پروب طور استعمال ڪرڻ بابت تجزيي مان اچي ٿو، جيئن دماغ جي مائيٽوڪانڊريا واري مطالعي ۾ خلاصو ڏنو ويو آهي، جنهن ان سبب DCFDA کي رد ڪيو. انهن ڏيکاريو ته رنگ آهستي ردعمل ڪري ٿو، اڻڄاتل اسٽوڪيوميٽري سان، معتبر ڪئليبريشن کان سواءِ، ۽ اهڙن مرڪبن سان به جيڪي ROS ناهن. پروب جنهن شيءِ کي ماپي ٿو، ان کي وڌائي به ٿو: DCFH جي هڪ اليڪٽران واري آڪسائيڊيشن هڪ DCF ريڊيڪل پيدا ڪري ٿي، جيڪو آڪسيجن سان ردعمل ڪري سپر آڪسائيڊ ٺاهي ٿو، ۽ اهو ڊسميوٽيشن ذريعي وڌيڪ پيرو آڪسائيڊ ٺاهي ٿو. پڙهت جزوي طور اها ڪيميا پاڻ پيدا ڪري ٿي، جنهن کي رپورٽ ڪري ٿي.

ان مان ڪا به ڳالهه DCFDA کي بيڪار نٿي بڻائي. اها ان کي شروعاتي ڇنڊڇاڻ جي جاچ بڻائي ٿي، نه سڃاڻپ جي جاچ. DCF فلوريسنس ۾ واڌ جو مطلب آهي ته آڪسائيڊنٽ تي دارومدار رکندڙ پروب جي آڪسائيڊيشن وڌي آهي. ان جو مطلب اهو ناهي ته پيرو آڪسائيڊ وڌيو آهي، ۽ يقيناً اهو به ناهي ته ڪُل ROS وڌيا آهن؛ اهڙي مقدار ڪو هڪ پروب نٿو ماپي. ميٿيلين بلو جي اڳوڻي ڪم ۾، جيڪو هڪ مائيڪرومولر کان مٿي DCF آڪسائيڊيشن تي ڀاڙيندو هو، پرو آڪسائيڊنٽ اثر رپورٽ ڪيا ويا، جڏهن ته ساڳئي دور جي ٻين نظامن ۾ پيرو آڪسائيڊ سبب سيل جي موت کان بچاءُ رپورٽ ڪيو ويو. مختلف ريڊاڪس حالتن ۾ ساڳئي رنگ بابت ٻئي مشاهدا صحيح ٿي سگهن ٿا، ۽ رڳو DCF جو نتيجو نٿو ٻڌائي سگهي ته ڪهڙي آڪسائيڊنٽ سگنل پيدا ڪيو. دماغ جي مائيٽوڪانڊريا واري اڳوڻي ڪم جي اهميت اها آهي ته ان هن شروعاتي جاچ کي پيرو آڪسائيڊ جي ڪئليبريٽ ٿيل ماپ سان مٽايو ۽ مقدار کي سڌي طرح معلوم ڪيو: رڳو هڪ سؤ نينومولر رنگ به آزمائشي هر سبسٽريٽ ۽ ساهه کڻڻ واري حالت ۾ پيرو آڪسائيڊ جي خارج ٿيڻ کي ڪيترائي ڀيرا وڌائي ڇڏيو.

DCFDA ۾ ميٿيلين بلو سان لاڳاپيل هڪ وڌيڪ ڦندو به آهي. رنگ تمام گهڻو رنگين ۽ ريڊاڪس طور فعال آهي، تنهنڪري اهو فلوريسنس کي ڦڪو ڪري سگهي ٿو، روشنيءَ جي اخراج کي دٻائي سگهي ٿو، يا سيل جي ROS کان آزاد نموني پروب جي ڪيميا کي آڪسائيڊ ڪري سگهي ٿو. رنگ ۽ پروب سان، پر سيلن کان سواءِ، هڪ ڪنٽرول اختياري سينگار ناهي. اهو ئي تجربو ٻڌائي ٿو ته ڇا رنگ پروب سان پاڻ لهه وچڙ ڪري ٿو.

اسپن ٽريپنگ ۽ آڪسيجن جو استعمال: سڃاڻپ ۽ وهڪرو

جتي فلوريسنٽ پروب ٻڌائين ٿا ته ڪا آڪسائيڊ ٿي سگهندڙ شيءِ ظاهر ٿي آهي، اتي اسپن ٽريپن سان اليڪٽران اسپن ريزوننس ان جي اصل سڃاڻپ بابت وڌيڪ ويجهو جواب ڏئي ٿو. ميٿيلين بلو جي فوٽو ڪيميا واري ڪلاسيڪي مطالعي رنگ، اسڪوربيٽ ۽ روشنيءَ مان اسڪوربيٽ ريڊيڪل ڳولڻ لاءِ ESR استعمال ڪيو، پوءِ آڪسيجن جي استعمال وارن تجربن ۾ پيرو آڪسائيڊ جي ٺهڻ ۽ اسپن ٽريپنگ وارن تجربن ۾ لوهه جي ڪيٽالسس سان هائيڊروڪسيل ريڊيڪل جي ٺهڻ کي ڏيکاريو. هر ٽيڪنڪ ان سوال جو جواب ڏنو، جيڪو ٻيون نه ڏئي سگهيون: ESR ريڊيڪل جي سڃاڻپ ڏني، آڪسيجن جي استعمال ڪنهن به فلوريسنٽ پروب کان آزاد ردعمل جو وهڪرو ڏنو، ۽ گڏيل نتيجن ڏيکاريو ته ساڳئي روشن ڪيل نظام ۾ سنگليٽ آڪسيجن ۽ ريڊيڪل، ٻنهي جا رستا ڪم ڪري رهيا هئا.

1984 جو اهو نتيجو اڄ به خبرداريءَ جي ليبل وانگر پڙهجي ٿو. روشني ۽ ريڊيوس ڪندڙ مادو موجود هئڻ تي رنگ پيرو آڪسائيڊ پيدا ڪيو، ۽ لوهه موجود هئڻ تي نظام هائيڊروڪسيل ريڊيڪل پيدا ڪيو، جيڪو ان گروهه ۾ سڀ کان وڌيڪ ردعمل ڪندڙ صورت آهي. ليکڪن ان کي اک ۾ موجود اسڪوربيٽ سان ڳنڍيو ۽ اکين ۾ بي احتياطيءَ سان استعمال تي سوال اٿاريو. اڄ جي پڙهندڙن کي حالتون ڌيان ۾ رکڻ گهرجن: روشني، گڏ ريڊيوس ڪندڙ مادو، گڏ لوهه. انهن مان ڪنهن به هڪ کي هٽايو ته اهو رستو ڪمزور ٿي وڃي ٿو يا ختم ٿي وڃي ٿو.

آڪسيجن اليڪٽروڊ پنهنجي اهميت ٻئي نموني ثابت ڪن ٿا. ڪلارڪ قسم جو اليڪٽروڊ آڪسيجن جو خالص استعمال ماپي ٿو، جنهن مان ثابت ٿئي ٿو ته رنگ سان هلندڙ ريڊاڪس ڪيميا ماليڪيولي آڪسيجن استعمال ڪري رهي آهي، ۽ اهو اهڙي حرڪي معلومات ڏئي ٿو، جيڪا ڪو فلوريسنس وارو مصنوعي اثر جعلسازيءَ سان نٿو ٺاهي سگهي. اهو پيداوار جي سڃاڻپ نٿو ڪري. پيرو آڪسائيڊ، سپر آڪسائيڊ ۽ پاڻيءَ جي ٺهڻ، ۽ سنگليٽ آڪسيجن جي زوال، سڀ آڪسيجن استعمال ڪن ٿا. سڃاڻپ کان سواءِ وهڪرو اوترو ئي اڻپورو آهي، جيتري وهڪري کان سواءِ سڃاڻپ؛ تنهنڪري مضبوط تحقيقي مقالا اليڪٽروڊ کي پيرو آڪسائيڊ جي ڪئليبريٽ ٿيل جاچ يا ٽريپ سان گڏ استعمال ڪن ٿا.

اينٽي آڪسيڊنٽ نتيجا متضاد ڇو ٿين ٿا

ٽنهي پڙهتن کي ڀرسان رکو ته ميٿيلين بلو بابت تحقيقي ادب جا ظاهري تضاد، طريقن جي فرق ۽ ٽن حياتياتي حقيقتن سان واضح ٿي وڃن ٿا.

پهريون، رنگ اليڪٽران منتقل ڪندڙ به آهي ۽ پيرو آڪسائيڊ جو ذريعو به. اليڪٽرانن کي ساهه کڻڻ واري عمل جي انهن هنڌن کان پري موڙي، جتي آڪسيجن ٻي صورت ۾ سپر آڪسائيڊ بڻجي ها، اهو هڪ ROS کي گهٽائي سگهي ٿو؛ ساڳئي وقت ان جي ريڊيوس ٿيل صورت آڪسيجن کي سڌو پيرو آڪسائيڊ ۾ ريڊيوس ڪري ٻي ROS کي وڌائي ٿي. تنهنڪري مائيٽوڪانڊريا جي ريڊاڪس ڪيميا ۽ ان ۾ باءِ پاس واري ڪردار تي ڪم ڪندڙ ليبارٽري کي پروب تي دارومدار رکندڙ جوابن جي توقع رکڻ گهرجي: ساڳئي ڪيويٽ ۾ سپر آڪسائيڊ لاءِ حساس پڙهت گهٽجي ٿي، جڏهن ته پيرو آڪسائيڊ جي پڙهت وڌي ٿي.

ٻيو، گهٽ مقدار ۾ پيرو آڪسائيڊ رڳو نقصان نه، هڪ سگنل به آهي. اڳوڻي ڪم کان پوءِ ٿيل ڪوئي جي دماغ جي مائيٽوڪانڊريا واري مطالعي ۾ رڳو پنجاهه نينومولر رنگ مان پيرو آڪسائيڊ جي پيداوار ملي، جڏهن ته علاج واري سطح تي مائيٽوڪانڊريا جي DNA ۾ نقصان نه ٿيو، ۽ اڳواٽ استعمال کان پوءِ روٽينون سبب ٿيندڙ نقصان کان بچاءُ مليو. رڳو هڪ سؤ مائيڪرومولر تي، جيڪو علاج واري حد کان تمام گهڻو مٿي آهي، رنگ DNA جي چونڊيل ٽڪرن کي نقصان پهچايو؛ ۽ ڳاڙهي روشنيءَ سان گڏ ويهه مائيڪرومولر رنگ سنگليٽ آڪسيجن پيدا ڪئي، جنهن آزمائشي سڀني ٽڪرن کي نقصان پهچايو. تجويز ڪيل ميڪانيزم هارميٽڪ آهي: پيرو آڪسائيڊ جي هلڪي پيداوار Nrf2 سان لاڳاپيل اينٽي آڪسيڊنٽ دفاعن ۽ نون مائيٽوڪانڊريا جي ٺهڻ کي متحرڪ ڪري ٿي، تنهنڪري مختصر مدي واري پرو آڪسائيڊنٽ پڙهت، ڊگهي مدي واري اينٽي آڪسيڊنٽ نتيجي کان اڳ اچي ٿي. هڪ ڪلاڪ تي پڙهيل جاچ ۽ هڪ ڏينهن تي پڙهيل جاچ ۾ اختلاف ٿي سگهي ٿو، ڇو ته انهن جي وچ ۾ حياتياتي حالت بدلجي وئي.

ٽيون، روشني طئي ڪري ٿي ته ڪهڙو ماليڪيول موجود به آهي. روشني رنگ مان ميٿائل گروپ هٽائي ان کي Azure B ۽ لاڳاپيل پيداوارن ڏانهن بدلائي ٿي، ۽ پيالي مٿان خوردبين جو ڏيئو ئي ان کي فوٽو سينسٽائز ڪرڻ لاءِ ڪافي آهي. اونداهيءَ ۽ روشنيءَ ۾ ٿيل تجربا مختلف تجربا آهن، ۽ ڪنهن به پروٽوڪول جي روشني ۽ رنگ کي سنڀالڻ جي ڪنٽرولن واري حصي کي انهن سان اهڙيءَ طرح ئي ورتاءُ ڪرڻ گهرجي.

ڪنٽرولن جو گهٽ ۾ گهٽ سيٽ، ۽ ڪنهن به دعويٰ کي ڪيئن پڙهجي

هيٺ ڏنل مقابلو هن مضمون لاءِ اصل حوالاتي مواد آهي. ميٿيلين بلو بابت ڪنهن به ROS نتيجي کي قبول ڪرڻ کان اڳ ڏسو ته ليکڪن ڪهڙي قطار پوري ڪئي ۽ ڪهڙي ڇڏي ڏني.

ان مان پڙهڻ لاءِ هڪ عملي اصول نڪري ٿو. پيرو آڪسيڊيز سان، ڪئليبريٽ ٿيل ۽ ڪيٽيليز جي چڪاس سان هلندڙ Amplex، پيرو آڪسائيڊ بابت ثبوت آهي. DCFDA غير مخصوص پروب آڪسائيڊيشن بابت ثبوت آهي، ۽ ان کان وڌيڪ ڪجهه به نه. ريڊيڪل ختم ڪندڙ مادن جي ڪنٽرولن سان اسپن ٽريپنگ، ريڊيڪل جي سڃاڻپ بابت ثبوت آهي. آڪسيجن جو استعمال وهڪري بابت ثبوت آهي. ڪو جملو، جيڪو پنهنجي جاچ جي سهاري کان وڌيڪ دعويٰ ڪري، ڀلي ڪيتري به اعتماد سان لکيل هجي، رنگ بابت نه، پروب بابت جملو آهي. مقدار تي دارومدار ۽ هارميٽڪ حد، مائيٽوڪانڊريا ۾ اليڪٽرانن جي وهڪري، رنگيل نمونن ۾ جاچ سان مداخلت، ۽ خوردبيني روشنيءَ جي مصنوعي اثرن بابت لاڳاپيل بحث انهن مان هر نڪتي کي اڳتي وڌائين ٿا، ۽ هر نڪتو پنهنجي جاءِ ڀريندڙ حوالي جي مٽجڻ کان پوءِ به صحيح رهي ٿو.