آرٽيڪل

DNA ۽ RNA کي رنگڻ لاءِ ميٿيلين بلو: جيلن ۽ جھلين ۾ استعمال

DNA ۽ RNA کي رنگڻ لاءِ ميٿيلين بلو: جيلن ۽ جھلين ۾ استعمال

هڪ شاگرد اگاروز جيل هلائي ٿو، ان کي ميٿيلين بلو سان رنگي ٿو، ۽ جتي نمايان پٽي جي اميد هئي اتي ڪجهه به نٿو ڏسي. ڀر واري ڪم جي جاءِ تي، هڪ پوسٽ ڊاڪٽرل محقق ساڳئي نيري بوتل سان ناردرن جھلي رنگي ٿو ۽ ٽن منٽن ۾ چٽيون رائبوسومل پٽيون حاصل ڪري ٿو. شاگرد نتيجو ڪڍي ٿو ته جيل ناڪام ٿيو. جيل ناڪام نه ٿيو هو. ٻئي ڪم مختلف هئا، ۽ ساڳيو رنگ انهن کي مختلف حساسيت، مختلف پسمنظر ۽ ايندڙ مرحلن لاءِ مختلف اصولن سان پورو ڪري ٿو.

ميٿيلين بلو سان DNA رنگڻ ۽ ميٿيلين بلو سان RNA رنگڻ جي ڪيميا ساڳي آهي، پر مقصد ساڳيو ناهي. جيل ۾، رنگ ٻڌائي ٿو ته هڪ سوراخدار ميٽرڪس اندر ڪيترو نيوڪليڪ ايسڊ موجود آهي. جھلي تي، اهو ٻڌائي ٿو ته منتقلي ڪامياب ٿي يا نه ۽ لينن ۾ نمونا هڪجهڙي مقدار ۾ وڌا ويا يا نه. جڏهن اهو فرق واضح ٿئي ٿو، تڏهن پروٽوڪول، ڳولڻ جون حدون ۽ مطابقت جون حدون سمجهه ۾ اچن ٿيون.

مختصر جواب

ميٿيلين بلو هڪ هموار، مثبت چارج وارو رنگ آهي، جيڪو نيوڪليڪ ايسڊن سان غير ڪوويلنٽ ۽ موٽائي سگهجندڙ نموني ڳنڍجي ٿو. ان ۾ فاسفيٽ ڏانهن برقي ساڪن ڪشش، بيس جوڙن جي وچ ۾ داخل ٿيڻ ۽ ننڍڙي نالي سان ڳانڍاپو گڏجي ڪم ڪن ٿا. اهو ڳانڍاپو موٽائي سگهجڻ ئي اهم ڳالهه آهي. پٽين کي رنگي، نظر ايندڙ روشنيءَ ۾ ڏسي، انهن جو رڪارڊ ٺاهي سگهجي ٿو، پوءِ ڪلوننگ، هائبرڊائيزيشن يا ٻيهر پروب لڳائڻ لاءِ رنگ هٽائي يا صفائي ڪري سگهجي ٿي.

ٻٽي زنجير واري DNA جي اگاروز جيل کي ميٿيلين بلو سان رنگڻ لاءِ معياري تيز نسخو پاڻيءَ ۾ 0.02 سيڪڙو w/v (200 مائڪروگرام في mL) آهي، جنهن ۾ لڳ ڀڳ 15 منٽ رنگڻ ۽ لڳ ڀڳ 15 منٽ پاڻيءَ سان رنگ هٽائڻ شامل آهي، ۽ جيل کي اڇي روشنيءَ واري باڪس تي ڏٺو وڃي ٿو. جھلين لاءِ، ناردرن بلاٽ جو روايتي نسخو pH 5.2 جي ويجهو سوڊيم ايسيٽيٽ ۾ 0.02 کان 0.04 سيڪڙو رنگ آهي؛ منتقلي ۽ جڪڙڻ کان پوءِ ڪيترن منٽن تائين رنگيو وڃي ٿو، پوءِ پاڻيءَ سان ڌوئي هائبرڊائيزيشن کان اڳ رنگ مڪمل هٽايو وڃي ٿو. حساسيت محدود آهي: سٺين حالتن ۾ هر جيل پٽيءَ لاءِ ڏهن کان سوين نانوگرام، جڏهن ته محتاط رهنمائي 0.5 کان 1 مائڪروگرام ڄاڻائي ٿي. اها مقدار ايٿيڊيم برومائيڊ ۽ SYBR رنگن جي ڀيٽ ۾ ڪيترن ڏهائي درجن وڌيڪ آهي. جھلين تي ڪنهن هڪ ٽرانسڪرپٽ لاءِ ڪا ڪارائتي ڳولڻ جي حد ناهي، ڇاڪاڻ ته رنگ بنيادي طور گهڻي مقدار ۾ موجود رائبوسومل RNA ۽ وڌل مواد جي ڪل مقدار ڏيکاري ٿو. ڪنهن به نسخي ۾ پرچون سپليمينٽ جو محلول متبادل طور استعمال نه ڪريو. تصديق ٿيل طريقا تجزياتي معيار جي رنگ، واضح طور مقرر ڪيل بفرن ۽ RNA سان ڪم ڪندي RNase کان پاڪ هٿ چراند تي ٻڌل آهن.

ڳنڍجڻ ڪيئن ڪم ڪري ٿو، ۽ ڪٿي ڀلائي ٿو

ڪارائتي نموني جا ٽي حصا آهن. پهريون، مثبت چارج وارو حلقن جو نظام منفي چارج واري فاسفيٽ ڍانچي ڏانهن ڇڪجي ٿو. اسپيڪٽروسڪوپي واري تحقيق موجب گهٽ لوڻ ۾ اهو برقي ساڪن حصو غالب هوندو آهي، جڏهن ته ماڊلنگ ۽ ماليڪيولي حرڪيات ٻٽي زنجير واري DNA لاءِ بيسن جي وچ ۾ داخل ٿيڻ ۽ ننڍڙي نالي سان ڳنڍجڻ کي مستحڪم طريقا سمجهن ٿا، جيئن ميٿيلين بلو جي DNA سان ڳنڍجڻ بابت هڪ اسپيڪٽروسڪوپي مطالعي ۾ خلاصو ڏنل آهي. ٻيو، GC لاءِ ڪجهه ترجيح موجود آهي: ماڊلنگ CpG ۽ GpC مرحلن کي ترجيح ڏئي ٿي ۽ تجربا GC سان ڀرپور ٻٽي زنجيرن سان ترجيحي ڳانڍاپو ٻڌائين ٿا، جيئن ميٿيلين بلو جي بيسن جي وچ ۾ داخل ٿيڻ جي ترجيحن بابت ڪم ۾ ڄاڻايل آهي؛ پر AT واريون ٻٽيون زنجيرون به ڳنڍجن ٿيون. معمول جي رنگائي ترتيب لاءِ مخصوص ناهي. ٽيون، هڪ زنجير وارو DNA ۽ RNA گهڻو ڪري برقي ساڪن ڪشش ۽ دستياب بيسن ۽ ٻٽي زنجير وارن حصن سان هڪ ٻئي مٿان ترتيب وٺڻ ذريعي ڳنڍجن ٿا، جنهن ڪري رنگڻ جي شدت ڊيگهه، ترتيب ۽ ثانوي بناوت سان بدلجي ٿي.

ان مان ٻه نتيجا نڪرن ٿا. ڳنڍجڻ غير ڪوويلنٽ هجڻ ڪري، رنگ ڌوئڻ سان نڪري وڃي ٿو. پولي اڪريلامائيڊ جون پٽيون جلدي ڦڪيون ٿين ٿيون، جيستائين انهن کي ڄاڻي واڻي مستقل نه ڪيو وڃي. مستقل جڪڙڻ جو هڪ خاص طريقو ان ڪري ئي موجود آهي جو عام رنگائي عارضي هوندي آهي، جيئن PAGE جيلن لاءِ Soto ۽ Draper بيان ڪيو آهي. رنگ روشنيءَ لاءِ حساس ڪندڙ مادو هجڻ ڪري، آڪسيجن جي موجودگيءَ ۾ رنگيل DNA تي ڊگهي وقت تائين تيز روشني گوانِين کي آڪسائيڊ ڪري سگهي ٿي ۽ آخرڪار زنجيرن ۾ ڪٽ وجهي سگهي ٿي؛ اهو عمل ميٿيلين بلو جي حساس ڪرڻ سان گوانِين جي آڪسائيڊيشن بابت ڪم ۾ تفصيل سان بيان ٿيل آهي. اڇي روشنيءَ ۾ مختصر ڏسڻ سان روايتي ايٿيڊيم برومائيڊ طريقن ۾ UV سبب ٿيندڙ ڄاتل نقصان کان بچجي ٿو، ۽ تياريءَ لاءِ DNA واپس حاصل ڪرڻ ۾ اهو حقيقي فائدو آهي. نظر ايندڙ روشني گهٽ نقصانڪار آهي، بي ضرر ناهي. جڏهن DNA کي ڪلون ڪرڻو هجي ته روشنيءَ جو وقت مختصر رکو. انهيءَ احتياط پٺيان وسيع فوٽوڪيميا لاءِ، ميٿيلين بلو جي فوٽوڪيميا جا ٻه رستا ڏسو. ريڊاڪس جوڙي ۽ چارج جي حالتن لاءِ، جيڪي سمجهاين ٿيون ته آڪسائيڊ ٿيل روپ ڇو ڳنڍجي ٿو ۽ گهٽايل روپ ڇو نٿو ڳنڍجي، ميٿيلين بلو جي بناوت ۽ خاصيتن جي ڪيميا ڏسو.

پهريون ڪم: جيلن اندر رنگڻ

جيل رنگڻ هڪ سوال جو جواب ڏئي ٿو: ڇا هن پٽيءَ ۾ ايترو نيوڪليڪ ايسڊ آهي جو اک سان ڏسي سگهجي؟ اگاروز ۾ ٻٽي زنجير وارو DNA سڀ کان وڌيڪ چڱيءَ طرح جاچيل صورت آهي. Flores ۽ ساٿين جي ميٿيلين بلو سان جيل رنگڻ جي اصل طريقي 1 سيڪڙو اگاروز تي 0.02 سيڪڙو واري تيز پروٽوڪول جي تصديق ڪئي ۽ پوءِ DNA جي ڪامياب واپسي ۽ ڪلوننگ ڏيکاري. ساڳيو فراهم ڪندڙ جو پروٽوڪول IBI Scientific جي ميٿيلين بلو پراڊڪٽ واري صفحي تي به آهي، جتي 0.04 سيڪڙو واري جھلي جي نسخي ۽ تيز جيل واري طريقي کي گڏ ڄاڻايو ويو آهي.

عملي ڪم جو طريقو:

  1. جيل کي معمول مطابق هلايو. اليڪٽروفوريسس کان پوءِ رنگيو، ان دوران نه، جيستائين تبديل ٿيل طريقي لاءِ منتقلي يا الڳ ڪرڻ جي صلاحيت جي تصديق ٿيل نه هجي.
  2. ڊسٽل پاڻيءَ ۾ 0.02 سيڪڙو w/v ميٿيلين بلو ۾ لڳ ڀڳ 15 منٽ ٻوڙيو، ۽ هلڪي لوڏ ڏيو.
  3. پاڻي ڪيترائي ڀيرا مٽائي، ڪل لڳ ڀڳ 15 منٽ رنگ هٽايو، جيستائين ميٽرڪس جو پسمنظر گهٽجي ۽ پٽيون نمايان ٿين.
  4. اڇي روشنيءَ واري روشن ڪندڙ اوزار تي ترت تصوير ڪڍو.

اگاروز ۽ پولي اڪريلامائيڊ جو رويو مختلف آهي. اگاروز ميٽرڪس ۾ رنگ روڪي رکي ٿو، تنهنڪري رنگ هٽائڻ سست مرحلو آهي. پولي اڪريلامائيڊ جا سنها جيل جلدي رنگجن ٿا، پر رنگ به جلدي وڃائين ٿا؛ اهو تياريءَ لاءِ پٽي ڪٽي ڪڍڻ ۾ مدد ڪري ٿو، پر ڊگهي مدي واري رڪارڊ لاءِ نقصانڪار آهي. پولي اڪريلامائيڊ ۾ مصنوعي اوليگونيوڪليوٽائيڊن جي جاءِ ساڳئي 0.02 سيڪڙو نسخي سان 20 کان 30 منٽن ۾ معلوم ڪري سگهجي ٿي، جيڪڏهن بار بار پاڻيءَ سان ڌوئجي ۽ قائم ڪيل Current Protocols طرز جا PAGE طريقا اختيار ڪجن. تياريءَ لاءِ اوليگونيوڪليوٽائيڊن بابت، هلڪي TBE ۾ لڳ ڀڳ 0.0002 سيڪڙو جا تمام هلڪا طريقا ڪيترن ڪلاڪن دوران استعمال ٿيڻ جا احوال موجود آهن، پر انهن لاءِ ثبوت نسبتاً ڪمزور آهن.

DNA ۽ RNA جو فرق اهم آهي. ٻٽي زنجير وارو DNA سڀ کان مضبوط منظم ڳانڍاپو ڏئي ٿو. RNA ۽ هڪ زنجير وارو DNA به رنگجن ٿا، پر وڌيڪ ڪمزور ۽ گهٽ اڳڪٿي لائق نموني. فارملڊيهاائيڊ اگاروز RNA جيلن لاءِ، اڪثر ليبارٽريون جيل اندر نيري رنگائي ڇڏي، RNA کي پهرين جھليءَ تي منتقل ڪن ٿيون، پوءِ اتي رنگين ٿيون. اهڙي تبديلي ڪمزور جيل سگنل بدران وڌيڪ چٽو جھلي سگنل ۽ وڌل مقدار جو رڪارڊ ڏئي ٿي.

ٻيو ڪم: جھلين تي رنگڻ

جھلي رنگڻ هڪ مختلف سوال جو جواب ڏئي ٿو: ڇا منتقلي ڪامياب ٿي، ۽ ڇا لينون ڀيٽڻ لائق آهن؟ روايتي استعمال Herrin ۽ Schmidt جو موٽائي سگهجندڙ ناردرن بلاٽ رنگ آهي، جنهن ۾ اصل طور pH 5.0 تي 50 mM سوڊيم ايسيٽيٽ ۾ 0.04 سيڪڙو رنگ 2 کان 3 منٽن لاءِ استعمال ٿيندو هو، پوءِ پاڻيءَ سان ڌوئبو هو، ۽ هائبرڊائيزيشن کان اڳ SSPE ۾ هلڪي SDS سان هٽائي سگهبو هو.

گهڻو استعمال ٿيندڙ جديد طريقو هن ريت آهي:

  1. RNA يا بناوت کوليل DNA کي نائلون يا نائٽروسيليولوز تي منتقل ڪريو، پوءِ UV ڪراس لنڪنگ يا گرم ڪرڻ سان جڪڙيو، ته جيئن رنگڻ دوران نمونو ضايع نه ٿئي.
  2. اختياري، پر عام: جھليءَ کي لڳ ڀڳ 15 منٽ 5 سيڪڙو ايسيٽڪ ايسڊ ۾ آلو ڪريو.
  3. pH 5.2 جي ويجهو 0.3 کان 0.5 M سوڊيم ايسيٽيٽ ۾ 0.02 کان 0.04 سيڪڙو ميٿيلين بلو سان 5 کان 10 منٽ رنگيو.
  4. پاڻيءَ ۾ 5 کان 15 منٽ ڌوئي رنگ هٽايو، رڪارڊ ٺاهيو، پوءِ هائبرڊائيزيشن کان اڳ بچيل رنگ هٽايو.

ناردرن ڪم ۾ مثبت چارج وارو نائلون گهڻو استعمال ٿئي ٿو. نائٽروسيليولوز به ساڳئي ايسيٽڪ ايسڊ ۽ ايسيٽيٽ واري طريقي سان ڪم ڪري ٿو. تصوير کي منتقلي جي تصديق ڪرڻ، 28S ۽ 18S پٽين جي ڀيٽ ڪرڻ (يا بيڪٽيريا جي RNA لاءِ 23S ۽ 16S)، ليڊرن ۽ معيارن کي نشان ڏيڻ، ۽ ڪل RNA جي مقدار کي هڪجهڙو ڪرڻ جو اندازي وارو رڪارڊ رکڻ لاءِ استعمال ڪيو وڃي ٿو. شايع ٿيل ناردرن طريقا وڌل مقدار جي جاچ لاءِ رنگيل رائبوسومل پٽين جي مقدار ماپن ٿا؛ انهن ۾ ڊيري سائنس جو ڪم به شامل آهي، جنهن مقدار کي هڪجهڙو ڪرڻ لاءِ ميٿيلين بلو سان رنگيل رائبوسومل پٽيون استعمال ڪيون. سدرن جھليون به ساڳئي نموني ڏسي سگهجن ٿيون، پر ناردرن ۾ وڌل مقدار ۽ منتقلي جي جاچ لاءِ هن رنگ جو استعمال وڌيڪ قائم ٿيل آهي. سدرن DNA جي بناوت منتقليءَ کان اڳ کولي ويندي آهي، تنهنڪري جيل جي حساسيت جا انگ هتي سڌيءَ طرح لاڳو نٿا ٿين.

جيل رنگڻ ۽ جھلي رنگڻ جي ڀيٽ ڪندڙ گڏ رکيل ڪم جي طريقن جو خاڪو. جيل وارو رستو هلائڻ، رنگڻ، رنگ هٽائڻ ۽ اڇي روشنيءَ ۾ تصوير ڪڍڻ ڏيکاري ٿو. جھلي وارو رستو منتقلي، جڪڙڻ، رنگڻ، رڪارڊ ٺاهڻ، رنگ هٽائڻ ۽ پوءِ هائبرڊائيزيشن ڏيکاري ٿو. هر رستي سان ڳولڻ جي حدن ۽ موٽائي سگهجڻ بابت نوٽ ڏنل آهن.

ڳولڻ جون حدون ۽ پسمنظر: جتي نيرو رنگ پوئتي رهي ٿو

هيٺ ڏنل ڀيٽ ڄاڻي واڻي اندازي واري آهي. رنگ جي ڪارڪردگي جيل جي سيڪڙي، پٽيءَ جي ويڪر، روشنيءَ واري نظام ۽ رنگ هٽائڻ ۾ پابنديءَ تي دارومدار رکي ٿي. هر انگ کي مقدار جي درجي جو اندازو سمجهو، مقرر خاصيت نه.

رنگ ۽ صورتهر پٽيءَ لاءِ اندازي واري ڳولڻ جي حدمطلب
ميٿيلين بلو، اگاروز ۾ dsDNAبهتر ڪيل حالتن ۾ 40 کان 250 ng؛ محتاط اندازي ۾ 0.5 کان 1 مائڪروگرامتياريءَ لاءِ وڌل مقدار ۽ تدريسي جيلن لاءِ ڪافي. تمام گهٽ مقدار وارين پٽين لاءِ ڪمزور.
ميٿيلين بلو، PAGE ۾ ننڍو ssDNA يا RNA يا اوليگونيوڪليوٽائيڊلڳ ڀڳ 0.1 کان 0.5 مائڪروگرامڊيگهه ۽ بناوت تي دارومدار رکندڙ. ڪا هڪ سڀني لاءِ لاڳو حد ناهي.
ايٿيڊيم برومائيڊ، dsDNA اگاروزلڳ ڀڳ 1 کان 10 ngFlores جي ڀيٽ ۾ بهتر ڪيل نيري رنگ کان لڳ ڀڳ چار ڀيرا وڌيڪ حساس. UV جي ضرورت آهي.
SYBR Green I، dsDNAلڳ ڀڳ 60 pgفلوريسنس تصويرڪشي ضروري آهي.
SYBR Gold، DNA ۽ RNAلڳ ڀڳ 25 pgڪيترين صورتن ۾ ايٿيڊيم برومائيڊ کان ڏهن ڀيرن کان به وڌيڪ حساس.
چانديءَ جي رنگائي، PAGE نيوڪليڪ ايسڊلڳ ڀڳ 0.3 کان 0.9 ng؛ نيري کان چانديءَ جي رنگائي واري بهتر ڪيل سلسلي ۾ 100 pg RNA رپورٽ ٿيلتمام حساس، پر ڪيميائي طور پيچيده ۽ نموني جي واپسيءَ لاءِ نامناسب.
ٽوليڊين بلو، PAGE RNA ۽ اوليگونيوڪليوٽائيڊعملي مقدار سوين ng، لڳ ڀڳ 250 ng دستاويز ٿيلميٿيلين بلو وانگر نظر ايندڙ روشنيءَ ۾ ڏسجي ٿو، پر SYBR جي خاصيتن سان ڀيٽڻ لائق ڪا معياري حد ناهي.

پسمنظر تي ضابطو طئي ڪري ٿو ته محدود سگنل استعمال لائق آهي يا نه. آزاد رنگ تمام گهرو رنگ رکي ٿو، تنهنڪري چٽائي اڻ ڳنڍيل رنگ هٽائڻ سان حاصل ٿئي ٿي، پر ڳنڍيل رنگ نه هٽڻ گهرجي. وڌيڪ ڳاڙهو رنگ وارو محلول حساسيت گهٽ ئي وڌائي ٿو. اهو گهڻو ڪري رنگ هٽائڻ جو وقت وڌائي ٿو. ساڳئي جيل، جھلي ۽ ڪئميرا تي مختلف هلڪين مقدارن جو سلسلو آزمائيو، ۽ صرف اها حد استعمال ڪريو جتي گڏيل شدت وڌل مقدار جي تناسب ۾ رهي. ميٿيلين بلو وڌل مقدار کي اڌ-مقداري نموني هڪجهڙو ڪرڻ ۾ مدد ڏئي ٿو. اهو وسيع مقداري حد وارو مقداري جاچ طريقو ناهي، ڇاڪاڻ ته جھليءَ جي گنجائش، منتقليءَ جي ڪارڪردگي، اشباع ۽ رنگ هٽائڻ لين کان لين بدلجن ٿا.

مطابقت جون حدون: رنگڻ کان پوءِ ڇا برقرار رهي ٿو

نيري رنگائيءَ کان پوءِ ڪلوننگ ڏيکاري وئي آهي. Flores ۽ ساٿين رنگيل اگاروز پٽيون ڪٽي ڪڍيون، DNA واپس حاصل ڪيو، ان کي جوڙيو ۽ سيلن ۾ داخل ڪيو؛ انهن UV سان ايٿيڊيم برومائيڊ کان پوءِ واري ڪلوننگ جي ڀيٽ ۾ بهتر ڪلوننگ رپورٽ ڪئي. امڪاني سبب روشنيءَ سبب گهٽ نقصان آهي، نه خود رنگ جو ڪو فائدو. اڇي روشنيءَ جو وقت مختصر رکو ۽ واپس حاصل ڪيل DNA کي عام جيل مان ڪڍڻ واري صفائيءَ مان گذاريو.

PCR ۽ سيڪوئنسنگ بابت ثبوت گهٽ آهن. بچيل رنگ نيوڪليڪ ايسڊن سان ڳنڍجي ٿو، تنهنڪري اينزائيمي مرحلن کان اڳ رنگ هٽايو ۽ صفائي ڪريو. نيري جيل مان صحيح طرح صاف ڪيل DNA جي ڪم ڪرڻ جي اميد آهي، پر مختلف پوليمريزن ۽ سيڪوئنسنگ جي ڪيميائي طريقن ۾ سڌو گڏ اچي ويندڙ رنگ کي برداشت ڪرڻ جي حد چڱيءَ طرح ماپيل ناهي. ان کي فرض نه ڪريو.

بلاٽ هائبرڊائيزيشن تڏهن مطابقت رکي ٿي جڏهن ترتيب سختيءَ سان هي هجي: منتقلي، جڪڙڻ، رنگڻ، رڪارڊ ٺاهڻ، رنگ هٽائڻ، هائبرڊائيزيشن. اها ترتيب Herrin ۽ Schmidt جي رٿا آهي. منتقليءَ کان اڳ رنگڻ، يا رنگ هٽائڻ ڇڏي ڏيڻ، هڪ مختلف طريقو آهي ۽ ان لاءِ پنهنجي تصديق گهرجي. رنگ هٽائڻ کان پوءِ، معياري پروب هٽائڻ ۽ ٻيهر پروب لڳائڻ معمول مطابق ٿين ٿا. ساڳئي رنگ خاندان سان سيل جي سطح تي رنگڻ، ۽ اهو سمجهڻ لاءِ ته جڪڙيل فلم وارو اصول جيئري سيلن جي طريقن تي ڇو لاڳو نٿو ٿئي، خوردبيني رنگائيءَ جو ائٽلس ڏسو.

تياريءَ لاءِ اگاروز ۽ نيري رنگ سان سڃاتل PAGE اوليگونيوڪليوٽائيڊن ۾ پٽي ڪٽي ڪڍڻ ڪم ڪري ٿو، بشرطيڪ مستقل جڪڙڻ وارو طريقو نه استعمال ڪيو وڃي. رنگ هٽائڻ کان پوءِ اليڪٽرواليوشن هڪ موٽائي سگهجندڙ ڳنڍيندڙ لاءِ ڪيميائي لحاظ کان ممڪن آهي، پر خاص ميٿيلين بلو لاءِ ضابطي هيٺ حاصل ٿيندڙ مقدار بابت ڊيٽا گهٽ آهن. اليوشن کان پوءِ لوڻ هٽايو يا ترسيب ڪريو.

بار بار ٿيندڙ ناڪاميون

جيل جون هلڪيون پٽيون اڪثر اهو مطلب رکن ٿيون ته رنگ جي بنياد تي ڏسجندڙ رنگائيءَ لاءِ مادّي جي مقدار تمام گهٽ آهي، خاص ڪري ننڍن هڪ زنجير وارن يا RNA هدفن لاءِ. وڌيڪ مقدار وڌو، تازو رنگ استعمال ڪريو، ڪنسنٽريشن وڌائڻ کان اڳ رنگڻ جو وقت وڌايو، ۽ رنگ هٽائڻ اڳ ۾ روڪيو. چٽائيءَ کان سواءِ مڪمل نيرو جيل اڪثر حد کان وڌيڪ رنگڻ يا پاڻي گهٽ ڀيرا مٽائڻ جو نتيجو هوندو آهي. PAGE پٽين جو ڦڪو ٿيڻ ڪيميا جي متوقع خاصيت آهي، رنگائيءَ جي ناڪامي نه. ترت تصوير ڪڍو. جھليءَ جو اڻبرابر پسمنظر وڪڙن، بلبلن، آڱرين جي نشانن، اڻبرابر لوڏ يا ٽڪرن ۾ ٿيل منتقلي ڏانهن اشارو ڪري ٿو. هائبرڊائيزيشن ڪنٽرول کان سواءِ ان کي اڻبرابر وڌل مقدار نه سمجهو. پکڙيل ۽ ڪمزور رائبوسومل نمونو ٽٽڻ جو مطلب ٿي سگهي ٿو، پر اڻپوري منتقلي، ڪل RNA جي تمام گهٽ مقدار (عام لينن ۾ چند کان ڏهن مائڪروگرامن تائين مقدار هوندي آهي)، يا حد کان وڌيڪ رنگ هٽائڻ به سبب ٿي سگهن ٿا. رنگ گهڻي مقدار ۾ موجود رائبوسومل RNA ڏيکاري ٿو. اهو ڪنهن مخصوص ٽرانسڪرپٽ کي نٿو ڏيکاري. اهو ڪم پروب جو آهي.

وڌاءَ کان سواءِ حفاظت ۽ هٿ چراند

ميٿيلين بلو سان ڪم ڪرڻ ايٿيڊيم برومائيڊ جي ڀيٽ ۾ آسان آهي، پر اهو بي ضرر ناهي. MilliporeSigma جي موجوده حفاظتي ڊيٽا شيٽ رنگ کي وات وسيلي اوچتي زهريت جي Category 4 ۾ رکي ٿي، يعني ڳڙڪائڻ سان نقصانڪار؛ Sigma-Aldrich جي ميٿيلين بلو SDS موجب ان کي منظور ٿيل فضلي جي رستي سان نيڪال ڪرڻ گهرجي. ايٿيڊيم برومائيڊ سان جينياتي زهريت جون وڌيڪ سخت خبرداريون لاڳو آهن، جن ۾ ان جي Sigma-Aldrich ايٿيڊيم برومائيڊ SDS ۾ نسل پيدا ڪندڙ سيلن تي شڪي اثر به شامل آهن. ان جا جيل ۽ محلول عام طور خطرناڪ ڪيميائي فضلي طور الڳ ڪيا ويندا آهن، جيئن Thermo Fisher جي نيوڪليڪ ايسڊ رنگن واري رهنمائي ۾ ڄاڻايل آهي. ٻنهي لاءِ SDS ۽ اداري جا اصول اختيار ڪريو. سڪل رنگ کي مضبوطيءَ سان بند ۽ سڪل رکو، استعمال وارو رنگ صرف پروٽوڪول جي اجازت موجب ٻيهر استعمال ڪريو، رنگيل جھليون فلٽر شيٽن جي وچ ۾ سڪل رکو، ۽ جيلن جون تصويرون پٽين جي پکڙجي وڃڻ کان اڳ ڪڍو.

ليبارٽريءَ واري مختصر ڳالهه ياد رکو. جيل اڇي روشنيءَ ۾ وڌيڪ وڌل مقدار تي ڏسجڻ جي جاچ ڪن ٿا. جھليون پروب جي حساس ڪم کان اڳ منتقلي ۽ وڌل مقدار جي جاچ ڪن ٿيون. هڪ ئي رنگ ٻنهي لاءِ ڪم اچي ٿو، محدود حساسيت، موٽائي سگهجندڙ ڳانڍاپي ۽ ڪم جي سخت ترتيب سان.