ميٿيلين بليو جو ڪيليبريشن وکر ٺاهڻ: بلينڪ، حد ۽ خطيت

ٻه تجزيه نگار ميٿيلين بليو جي هڪ ئي اسٽاڪ بوتل استعمال ڪن ٿا ۽ هر هڪ ڪيليبريشن وکر ٺاهي ٿو. پهرئين کي اصل نقطي مان لنگهندڙ سڌي ليڪ ملي ٿي ۽ هو اڻڄاتل نمونن کي اعتماد سان ماپي ٿو. ٻئي کي اهڙي ليڪ ملي ٿي جيڪا مٿئين پاسي مڙي ٿي، هڪ محور ڪٽيندڙ قدر جيڪو صفر جي ويجهو نٿو اچي، ۽ نمونن جا نتيجا جيڪي رقيق ڪرڻ سان بدلجن ٿا. ساڳيو رنگ، ساڳيو اوزار، ساڳي موج جي ڊيگهه. فرق مهارت جو ناهي. فرق رٿابنديءَ جو آهي: بلينڪ ۾ ڇا شامل ڪيو ويو، ڪهڙيون ڪنسنٽريشنون چونڊيون ويون، ۽ ڇا جاچيل حد ان علائقي اندر رهي جتي هڪ سادو ماڊل اڃا لاڳو ٿئي ٿو.

ڪيليبريشن وکر اوزار جي ردعمل ۽ ڪنسنٽريشن وچ ۾ هڪ معاهدو آهي، جيڪو رڳو انهن حالتن ۾ صحيح آهي جن ۾ اهو ٺاهيو ويو. ميٿيلين بليو لاءِ هن معاهدي جو هڪ ڄاتل ڪمزور پاسو آهي. رنگ پاڻيءَ ۾ پاڻ ۾ گڏجي ٿو، تنهنڪري روشني جذب ڪندڙ ڪيميائي صورت ڪنسنٽريشن سان بدلجي ٿي. اهڙي تبديليءَ کي ڍڪيندڙ وکر سڌو نه ٿيندو، ۽ ڪيتري به شمارياتي جاچ ان کي درست نه ڪندي. هي مضمون ڏيکاري ٿو ته وکر جي رٿابندي ڪيئن ڪجي ته جيئن ليڪ معنيٰ رکي: صحيح بلينڪ چونڊيو، حد کي مونومر واري علائقي اندر رکو، ورجايل تياريون درست نموني ڪريو، ۽ وکر جي مڙڻ کي شور بدران معلومات سمجهو.

شروعات بلينڪ سان ڪريو، معياري محلولن سان نه

بلينڪ صفر مقرر ڪري ٿو، ۽ ميٿيلين بليو لاءِ ان ۾ رنگ کان سواءِ سڀ ڪجهه هجڻ گهرجي. پاڻيءَ جو ساڳيو درجو، ساڳيو بفر ۽ pH، ساڳيا لوڻ، گڏيل محلل جو ساڳيو تناسب، ساڳيو گرمي پد. ڪيليبريشن لاءِ معياري محلول انهيءَ ساڳئي ميٽرڪس ۾ تيار ڪريو. ان جو سبب ڪيميائي آهي، رڳو رسمي ڪارروائي نه. لوڻ ۽ محلل مونومر، ڊائيمر ۽ وڏن مجموعن جي وچ ۾ توازن بدلائن ٿا، جنهن سان ماپ واري موج جي ڊيگهه تي اسپيڪٽرم بدلجي ٿو. رڳو پاڻيءَ وارو بلينڪ ميٽرڪس سبب ڪيميائي صورتن جي ورڇ ۾ آيل تبديليءَ کي درست نٿو ڪري سگهي. پاڻيءَ ۾ ميٿيلين بليو جي اسپيڪٽرا جو گڏيل تجزيو، جيڪو ان جي کليل رسائي واري رڪارڊ ذريعي دستياب آهي، سوڊيم ڪلورائڊ کي 0 کان 0.15 M تائين ان ڪري بدلائيندو رهيو جو آئنڪ طاقت توازن کي منتقل ڪري ٿي، ۽ لوڻ وڌڻ سان مجموعا ٺهڻ به وڌيو.

هڪ عملي نتيجو: ڪڏهن به ڊي آئنائزڊ پاڻيءَ ۾ ڪيليبريشن ڪري پوءِ فاسفيٽ بفر يا گندي پاڻيءَ جي فلٽريٽ ۾ نمونا نه ماپيو. جڏهن تجزئي هيٺ مادي کان خالي ميٽرڪس موجود نه هجي، تڏهن نموني ۾ ئي معياري مادو شامل ڪرڻ، اڻملندڙ ٻاهرين وکر کان بهتر آهي. پاڻيءَ وارن مقداري تجزين کي معتبر رکڻ بابت لاڳاپيل رهنمائي ميٽرڪس ۽ مداخلت واري بحث ۾ آهي، ۽ رنگن جي مقداري تجزين جا عام اصول تجزيي جي رٿابنديءَ واري جائزي ۾ بيان ٿيل آهن.

اهڙي حد چونڊيو جتي هڪ ڪيميائي صورت غالب هجي

664 nm جي ويجهو ڊگهي موج واري بينڊ تي مقدار طئي ڪرڻ ۾ اهو فرض ڪيو وڃي ٿو ته رنگ جو گهڻو حصو مونومر صورت ۾ آهي. سادي پاڻيءَ ۾ اهو مفروضو رڳو تڏهن صحيح رهي ٿو جڏهن محلول رقيق هجن، لڳ ڀڳ گهٽ مائڪرومولر واري علائقي ۾. شايع ٿيل تجرباتي ڍلان هن حد کي واضح ڪن ٿا: 1 cm سيلن ۾ لڳ ڀڳ 7 مائڪرومولر کان هيٺ رکيل ڪيليبريشن لڳ ڀڳ 82,000 M-1 cm-1 جي ڍلان ڏئي ٿي، جڏهن ته لڳ ڀڳ 37 مائڪرومولر تائين وڌايل ڪيليبريشن جي ڍلان گهٽجي لڳ ڀڳ 67,100 ٿي وڃي ٿي، ڇاڪاڻ ته مٿين معياري محلولن ۾ اڳ ئي قابلِ لحاظ ڊائيمر موجود آهي. هتي ڏنل هر عددِي ضريب سان لاڳاپيل حالتون ميٿيلين بليو جي اسپيڪٽرل حوالي ۾ ڄاڻايل آهن، جيڪو انگن جي ڀيٽ لاءِ صحيح هنڌ آهي؛ هي مضمون انهن کي رڳو حد مقرر ڪرڻ لاءِ استعمال ڪري ٿو.

رٿابنديءَ جا قاعدا سڌو سنئون هن مان نڪرن ٿا:

1. سڀ کان وڌيڪ ڪنسنٽريشن وارو معياري محلول ايترو رقيق رکو جو اسپيڪٽرم جي شڪل مستحڪم رهي. طريقي جي تياري دوران، رڳو هڪ موج جي ڊيگهه پڙهڻ بدران هر سطح لاءِ سڄي نظر ايندڙ حد، لڳ ڀڳ 550 کان 750 nm، اسڪين ڪريو. جيڪڏهن نارملائيز ڪيل اسپيڪٽرا جي شڪل ڪنسنٽريشن سان بدلجي ٿي، ته ڪيميائي حالت بدلجي رهي آهي ۽ حد تمام وسيع آهي.
2. مختلف سطحن تي 610 nm جي ويجهو جذبيت جو 665 nm جي ويجهو جذبيت سان تناسب ڏسندا رهو. ڪنسنٽريشن سان وڌندڙ تناسب جو مطلب آهي ته ڊائيمر وارو ڪلهو وڌي رهيو آهي ۽ مونومر ماڊل ناڪام ٿي رهيو آهي. هن تشخيصي اشاري جي وڌيڪ وضاحت مجموعا ٺهڻ ۽ ڪنسنٽريشن جي اثرن واري رهنمائي ۾ آهي.
3. گهٽ مائڪرومولر ڪم لاءِ 1 cm سيل استعمال ڪريو. لڳ ڀڳ 82,000 جي ڍلان سان، 5 مائڪرومولر لڳ ڀڳ 0.41 جذبيت ڏئي ٿو ۽ 10 مائڪرومولر لڳ ڀڳ 0.82 ڏئي ٿو؛ ٻئي گهڻن اوزارن لاءِ مناسب آهن.
4. وڌيڪ ڪنسنٽريشن وارن اسٽاڪ محلولن لاءِ، 1 کان گهڻو مٿي جذبيت قبول ڪرڻ بدران نوري رستو ننڍو ڪريو، پر ياد رکو ته ننڍو رستو نوري ماپ کي درست ڪري ٿو، ڪيميائي حالت کي نه. مجموعا ٺهڻ ڪنسنٽريشن تي دارومدار رکي ٿو، نوري رستي جي ڊيگهه تي نه؛ تنهنڪري وڌيڪ ڪنسنٽريشن واري اسٽاڪ لاءِ اڃا به ڪيميائي صورتن جي ورڇ کي ڌيان ۾ رکندڙ الڳ طريقي جي ضرورت آهي، نه ڪي رقيق مونومر واري وکر جي.

هن تصوير جي وڏي حصي پٺيان گڏيل فِٽ ۾ 1.1 مائڪرومولر کان 3.4 ملي مولر تائين جا 224 اسپيڪٽرا شامل هئا، ۽ ان ۾ ٽيٽرامر جو سگنل 34 مائڪرومولر کان هيٺ به سڃاڻپ لائق مليو. هي نتيجو احتياط جي ضرورت واضح ڪري ٿو: خطي حد اندازي کان وڌيڪ تنگ آهي، تنهنڪري ان کي فرض ڪرڻ بدران تصديق ڪريو.

سطحون، ورجايل تياريون ۽ ترتيب

ٽن نقطن وارو وکر ڪجهه به ثابت نٿو ڪري. ICH Q2(R2) جي توثيق واري رهنمائي خطيت جانچڻ لاءِ گهٽ ۾ گهٽ پنج ڪنسنٽريشنون گهري ٿي، ۽ صفر کان مٿي ڇهه کان اٺ سطحون وڌيڪ قائل ڪندڙ عملي وکر ڏين ٿيون، خاص ڪري مٿئين حصي جي ويجهو، جتي مجموعا ٺهڻ شروع ٿين ٿا. سطحن جي وچ ۾ فاصلو اهڙو رکو جو اهي نمونن جي گهربل حد کي ڍڪين، ۽ جتي وکر مڙڻ جو امڪان سڀ کان وڌيڪ هجي اتي وڌيڪ سطحون رکو؛ رڳو سهولت لاءِ چونڊيل هندسي سلسلو نه ٺاهيو.

هر سطح کي ٻه يا ٽي ڀيرا ماپيو، پر محلول الڳ الڳ تيار ڪريو، هڪ ئي فلاسڪ مان ٽي ڀيرا پڙهڻ نه وٺو. آزاد ورجايل تياريون محلول تيار ڪرڻ جي غلطي ظاهر ڪن ٿيون؛ هڪ فلاسڪ جون ورجايل پڙهڻيون رڳو اوزار جو شور ظاهر ڪن ٿيون. 2020 واري گڏيل مطالعي هر محلول کي ٽي ڀيرا ماپيو، جيڪو اڃا به هڪ مناسب بنيادي طريقو آهي. پڙهڻ جي ترتيب بي ترتيب رکو ته جيئن آهستي تبديلي، شيشي جي مٿاڇري تي جذب ٿيڻ يا گرمي پد جي تبديلي وکر جي مڙڻ جهڙي نظر نه اچي. ڪوارٽز ڪيوويٽ جي هڪ مطالعي ۾ 34 مائڪرومولر محلول مان لڳ ڀڳ 3 سيڪڙو رنگ 10 منٽن اندر مٿاڇري تي جذب ٿيندي مليو؛ تنهنڪري سڄي ماپ جي سلسلي ۾ رابطي جو وقت، ڪيوويٽ، صفائي ۽ ترتيب هڪجهڙا رکو.

وضاحتي حل ڪيل مثال (ماپيل ڊيٽا نه)

هيٺيان انگ حساب ڏيکارڻ لاءِ ٺاهيا ويا آهن. اهي ليبارٽريءَ جون ماپون نه آهن ۽ انهن کي ميٿيلين بليو جي ڊيٽا طور حوالو نه ڏيڻ گهرجي. اهم ڳالهه انهن جي چوڌاري ڪيل جاچن جو نمونو آهي.

فرض ڪريو ته ڇهه معياري محلول ساڳئي بفر ۾ آهن، نوري رستو 1 cm آهي، ۽ ملندڙ بلينڪ جي مقابلي ۾ 665 nm تي پڙهيا ويا آهن:

ڪنسنٽريشن جي مقابلي ۾ سراسري جذبيت جو سڌي ليڪ وارو فِٽ لڳ ڀڳ 0.0805 جذبيت يونٽ في مائڪرومولر جي ڍلان ڏئي ٿو، ۽ محور ڪٽيندڙ قدر صفر کان چند ملي جذبيت يونٽن اندر آهي. ڍلان کي نوري رستي جي ڊيگهه سان ورهائڻ ان کي ظاهري جذبي صلاحيت ۾ بدلائي ٿو: 0.0805 في مائڪرومولر لڳ ڀڳ 80,500 M-1 cm-1 جي برابر آهي، جيڪو پاڻيءَ ۾ مونومر جي غلبي واري حد سان ٺهڪي اچي ٿو. اهم جاچون R جو مربع نه آهن، جيڪو ٻنهي صورتن ۾ بهترين نظر ايندو. اهم ڳالهه صفر جي ويجهو محور ڪٽيندڙ قدر، S2 کان S5 تائين هڪجهڙو A610/A665 تناسب، ۽ ڪنهن رجحان کان سواءِ پکڙيل باقيات آهن. S6 تي تناسب جو وڌڻ هڪ صاف اشارو آهي ته يا ته اها سطح هٽايو، يا 7 مائڪرومولر کي هن ميٽرڪس ۽ اوزار جي ميلاپ لاءِ عارضي مٿئين حد قرار ڏيو.

ساڳين حالتن ۾ اڻڄاتل نموني جي 0.245 پڙهڻي سڌي طرح بدلجي ٿي: 0.245 کي 0.0805 في مائڪرومولر سان ورهائڻ سان لڳ ڀڳ 3.0 مائڪرومولر ملي ٿو، ان کان اڳ جو نموني کي رقيق ڪرڻ جو ڪو به عامل لاڳو ڪيو وڃي. نتيجو ان جي حالتن سان گڏ رپورٽ ڪريو: موج جي ڊيگهه، نوري رستو، بلينڪ جو ميٽرڪس، ڪيليبريشن جي حد ۽ تاريخ.

ڀرڻ لائق ڪيليبريشن ورڪ شيٽ

هر نئين ميٽرڪس لاءِ هي سانچو ليبارٽريءَ جي رڪارڊ ۾ نقل ڪريو. هڪ ميٽرڪس، هڪ شيٽ، هڪ وکر.

ريجنٽ جي صورت واري قطار رکڻ جو سبب آهي. تجارتي ميٿيلين بليو پاڻيءَ کان خالي لوڻ يا ٽرائي هائيڊريٽ جهڙو هائيڊريٽ ٿي سگهي ٿو، ۽ غلط مولر ماس هر مقرر ڪنسنٽريشن ۾ اڻڄاتل منظم غلطي آڻي ٿو. شروعاتي مادي جي خالصيت ۽ وضاحتن جي جاچ معيار ۽ درجي واري رهنمائي ۾ بيان ٿيل آهي.

آزاد جاچ واري معياري محلول سان تصديق ڪريو

ڪيليبريشن وکر کي ڪڏهن به پنهنجي ئي ڪم جي تصديق نه ڪرڻ گهرجي. فِٽ ڪرڻ کان پوءِ، الڳ وزن ڪري تيار ڪيل اسٽاڪ مان هڪ جاچ وارو معياري محلول تيار ڪريو، جنهن جي ڪنسنٽريشن قبول ڪيل حد جي وچ جي ويجهو هجي، ۽ ان کي اڻڄاتل نموني وانگر پڙهو. چند سيڪڙي اندر اتفاق تياريءَ جي سلسلي جي تصديق ڪري ٿو؛ اختلاف اوزار بدران اسٽاڪ يا رقيق ڪرڻ ڏانهن اشارو ڪري ٿو. نمونن جي هر بيچ سان جاچ وارو معياري محلول ورجايو. جيڪڏهن وکر بدليل نه هجي پر ان جي پڙهڻي بدلجي، ته نمونن تي شڪ ڪرڻ کان اڳ ڪم ۾ ايندڙ محلولن يا ڪيوويٽ تي شڪ ڪريو. هي هڪڙي عادت گهڻيون لڪل غلطيون پڪڙي ٿي: پاڻيءَ کان خالي مادي واري بوتل لاءِ هائيڊريٽ جو مولر ماس استعمال ڪرڻ، ڪيليبريشن کان ٻاهر مائڪروپائپيٽ، يا غلط آئنڪ طاقت تي تيار ڪيل بفر. ورڪ شيٽ ۾ ڍلان جي ڀرسان جاچ جي ريڪوري لکو، ته جيئن پوءِ پڙهندڙ ڏسي سگهي ته ليڪ جي جاچ ڪئي وئي هئي، رڳو ٺاهي نه وئي هئي.

غيرخطيت کي تشخيص طور پڙهڻ

جڏهن وکر مڙي ٿو، تڏهن ان خرابيءَ جي شڪل سبب جي سڃاڻپ ڪري ٿي. وڌيڪ جذبيت تي هيٺ ڏانهن مڙڻ، جڏهن اسپيڪٽرم جي شڪل نه بدلي هجي، اوزار ڏانهن اشارو ڪري ٿو؛ اڪثر ڀٽڪيل روشني مضبوط جذبيت کي اصل کان گهٽ ڏيکاري ٿي. وکر جي مڙڻ سان گڏ 610 nm وارو ڪلهو وڌڻ ڪيميائي حالت ڏانهن اشارو ڪري ٿو: ڊائيمر ۽ وڏا مجموعا مونومر کان مختلف انداز ۾ جذب ڪن ٿا. اهڙو بلينڪ جيڪو صفر نه ٿئي، يا معياري محلول جن جون پڙهڻيون وقت سان گهٽجن، ظرف ڏانهن اشارو ڪن ٿا: شيشي يا ڪيوويٽن جي مٿاڇري تي جذب ٿيڻ، خاص ڪري جيڪڏهن ماپ جي سلسلي ۾ رابطي جا وقت مختلف رهيا هجن. ۽ نقطن مان لنگهندڙ صاف سڌي ليڪ جيڪا پوءِ به نمونن جا غلط نتيجا ڏئي، ميٽرڪس ڏانهن اشارو ڪري ٿي: نمونا ڪيليبريشن وارن محلولن کان مختلف آهن، تنهنڪري وکر کي نموني جي ميٽرڪس ۾ ٻيهر ٺاهيو يا معياري مادو شامل ڪرڻ وارو طريقو اختيار ڪريو. هر صورت ۾ ڪنسنٽريشن جي مقابلي ۾ باقيات جو گراف ٺاهيو. بي ترتيب پکڙاءُ سڌي ليڪ واري ماڊل جي حمايت ڪري ٿو؛ مرڪ يا گهنج جهڙي شڪل ان کي R جي مربع جي ڪنهن به حد کان وڌيڪ ڀروسي سان رد ڪري ٿي، ۽ توثيق واري رهنمائي هن ڳالهه جي واضح تائيد ڪري ٿي.

ميٿيلين بليو سان هي نظم ڪارائتو ثابت ٿئي ٿو. ان جو مونومر بينڊ مضبوط آهي، ان جي ڪيميائي روين کي چڱيءَ طرح ڄاتو ويو آهي، ۽ ان جي خرابيءَ جون صورتون انگن کي بگاڙڻ کان اڳ اسپيڪٽرم ۾ پاڻ ظاهر ڪن ٿيون. وکر کي تنگ حد ۾ ٺاهيو، بلينڪ صحيح رکو، ورجايل تياريون آزاد نموني ڪريو، ۽ اسپيڪٽرا جي شڪل کي حد جو فيصلو ڪرڻ ڏيو. نتيجي ۾ ملندڙ ليڪ ننڍي آهي، پر ان تي هر نقطو صحيح آهي.

هن مضمون جا وضاحتي حساب طريقي کي ڏيکارڻ لاءِ ٺاهيل انگ استعمال ڪن ٿا. مڪمل حالتن سان ماپيل حوالاجاتي ضريب ڳنڍيل اسپيڪٽرل حوالي ۾ ڏنل آهن، ۽ مجموعا ٺهڻ بابت بنيادي مطالعو PMID 33251415 تي درج آهي.