Почему метиленовый синий используется как контрастная окраска при кислотоустойчивом окрашивании

Техник исследует мазок мокроты после полного цикла окрашивания. Красные палочки выделяются на синем фоне, и в отчете указывается наличие кислотоустойчивых бацилл. На следующий день другой препарат показывает равномерное синее поле без красных палочек, и его описывают как отрицательный на туберкулез. Один из этих отчетов утверждает больше, чем позволяет подтвердить препарат, и это не первый такой случай.

Проблема заключается в понимании принципа. Техник воспринял синий краситель как часть химии обнаружения, будто метиленовый синий помогает найти микобактерии. Это не так. К моменту, когда метиленовый синий попадает на препарат, тест уже завершен. Краситель только окрашивает фон, чтобы результат можно было прочитать. В этой статье объясняется назначение метиленового синего при кислотоустойчивом окрашивании, почему он синий, а не другого цвета, и какие выводы позволяет сделать красный цвет на синем фоне.

Краткий ответ

Кислотоустойчивое окрашивание — это дифференциальный тест, основанный на трех принципах. Карболовый фуксин, основной краситель, вводится во все клетки, включая микобактерии с восковидной оболочкой. Кислый спирт, обесцвечивающий реагент, удаляет красный краситель из обычных клеток, но не извлекает его из кислотоустойчивых клеток. Затем метиленовый синий, контрастный краситель, окрашивает все, что обесцветил кислый спирт, поэтому некислотоустойчивые клетки, клетки хозяина и остаточный материал становятся синими, а кислотоустойчивые бациллы остаются красными. Контрастная окраска обеспечивает различимость. Она не участвует в химии, которая делает клетку кислотоустойчивой.

Что делает каждый этап

Диаграмма ниже показывает распределение функций. Читайте ее слева направо как последовательность процедуры, а нижнюю часть как напоминание о том, что каждый тип окрашивания задает свой вопрос.

Сначала происходит проникновение. Микобактерии плохо воспринимают обычные водные красители, поскольку их оболочка необычно гидрофобна, поэтому протокол обеспечивает проникновение красителя. В методе Циля — Нильсена нагревание паром способствует прохождению содержащего фенол карболового фуксина через восковидную стенку. В холодном методе Киньона нагревание заменяется значительно более сильной формулой основного красителя, а некоторые модифицированные варианты без нагревания добавляют поверхностно-активные вещества. В документе American Society for Microbiology acid-fast stain protocols обе формулы представлены рядом, и разница в концентрации заметна: примерно 0,3 г основного фуксина на 100 мл для метода с нагреванием против около 4 г для холодного метода.

Вторым этапом является дифференциация. Кислый спирт, обычно 3 мл концентрированной соляной кислоты в 97 мл 95-процентного этанола, вымывает красный краситель из всех клеток, чья стенка не обладает специальной устойчивостью. Клетки с сохраненной липидной оболочкой микобактерий удерживают краситель. Это этап, на котором основан весь метод, и этап, наиболее чувствительный к технике выполнения, как описано ниже.

Последним этапом является создание контраста. Теперь на препарате находятся красные кислотоустойчивые клетки на почти бесцветном фоне обесцвеченных клеток. Метиленовый синий в концентрации 0,3% w/v возвращает этому фону видимость благодаря цвету, максимально удаленному от красного. Контрастное окрашивание является коротким: обычно 20–30 секунд в методе с нагреванием и до нескольких минут в некоторых вариантах холодного метода; время зависит от протокола, а не является свойством самого красителя.

Почему именно этот краситель и почему синий

Метиленовый синий — это катионный основной краситель, то есть его окрашенный ион несет положительный заряд и связывается с отрицательно заряженными поверхностями обесцвеченных бактерий, клеток хозяина и остаточного материала. OpenStax Microbiology описывает эту логику заряда как общий принцип действия основных красителей. Однако метиленовый синий не является химически уникальным в этом отношении. Кристаллический фиолетовый и сафранин также являются основными красителями. Выбор определяется оптикой, а не химией.

Красным палочкам нужен фон контрастного оттенка, и синий находится напротив красного в наиболее полезном для светлопольной микроскопии смысле. Сафранин был бы плохим контрастным красителем, поскольку его розово-красный оттенок слишком близок к сохранившемуся карболовому фуксину, что разрушило бы само различие, созданное процедурой. Кристаллический фиолетовый создал бы темно-фиолетовый фон, конкурирующий с тонкими красными бациллами за внимание. Лучшее доказательство того, что задача заключается в контрасте, а не в химии, — возможность замены: зеленые контрастные красители, такие как малахитовый зеленый и бриллиантовый зеленый, используются в некоторых ветеринарных и модифицированных протоколах, и тест по-прежнему работает, поскольку любой четко отличающийся оттенок выполняет ту же функцию.

Из этого следуют два практических вывода. Во-первых, стандартная рецептура не предусматривает регулирование pH; не следует путать обычный водный 0,3%-ный раствор с щелочными формулами, такими как метиленовый синий Леффлера, которые относятся к другой концепции окрашивания. Во-вторых, чрезмерное количество красителя вредит. В гистологической литературе отдельно отмечается, что слишком плотный синий фон может скрывать малое количество бацилл, поэтому более длительное заливание препарата, чем предусмотрено протоколом, ухудшает читаемость без пользы.

Химия оболочки, делающая тест возможным

Причина, по которой кислый спирт обеспечивает различие, заключается в оболочке микобактерий. Ее структурное ядро представляет собой комплекс миколил-арабиногалактан-пептидогликан: пептидогликан, связанный с арабиногалактаном, внешние концы которого несут очень длинноцепочечные миколовые кислоты, образующие богатую липидами наружную микомембрану с необычно низкой проницаемостью. Обзор наружной мембраны микобактерий подробно описывает эту архитектуру. Барьер работает в обоих направлениях. Он препятствует проникновению красителя, поэтому требуется нагревание или усиленный основной краситель, и препятствует извлечению красителя, поэтому кислый спирт не удаляет карболовый фуксин после его проникновения внутрь. Обычные бактерии не имеют такой оболочки и теряют краситель. Таким образом, кислотоустойчивость лучше понимать как явление липидного барьера, а не как химическое связывание фуксина с миколовыми кислотами.

Эта химия также объясняет распространенную загадку: микобактерии плохо и непредсказуемо окрашиваются методом Грама, иногда проявляясь как слабые бусинчатые формы или неокрашенные тени. Их гидрофобная стенка ограничивает проникновение кристаллического фиолетового. Кислотоустойчивое окрашивание — это не модифицированное окрашивание по Граму. Это другой дифференциальный принцип, основанный на другом свойстве клеточной стенки, как показывает сравнение простого окрашивания и окрашивания по Граму для двух других методов.

Три метода, три вопроса

Для более широкого семейства бактериальных методов с одним красителем см. атлас микроскопического окрашивания.

Что красный цвет на синем фоне не может доказать

Красные палочки означают, что организмы удержали карболовый фуксин после воздействия кислого спирта. Этот результат соответствует Mycobacterium tuberculosis, однако рекомендации CDC по диагностике туберкулеза прямо отмечают, что другие микобактерии также являются кислотоустойчивыми, поэтому для идентификации вида необходимы культуральные и молекулярные методы, а не цвет.

Ошибки техники чаще всего связаны с двумя промывками. Недостаточное обесцвечивание оставляет фоновый материал красным и способствует ложноположительной интерпретации. Чрезмерное обесцвечивание удаляет слабо удерживаемый основной краситель и способствует ложноотрицательным результатам. Слишком интенсивная контрастная окраска скрывает малое количество бацилл в синем фоне. Толстые мазки, осадки реагентов и загрязненная промывочная вода добавляют собственные артефакты.

Чувствительность ограничивается количеством организмов независимо от качества выполнения процедуры. Обычная микроскопия мазков требует примерно 5 000–10 000 бацилл на миллилитр мокроты, а более ранние обзоры данных CDC оценивали чувствительность окрашивания мазков примерно в 45–80% среди подтвержденных культурой случаев легочного заболевания. Поэтому отрицательный мазок никогда не исключает туберкулез. Текущие рекомендации CDC сохраняют посев вместе с каждым мазком и рекомендуют проводить амплификационное исследование нуклеиновых кислот как минимум для одного респираторного образца, когда рассматривается легочный туберкулез и результат может изменить дальнейшие действия.

Практическая работа относится к утвержденным протоколам

Учебные описания, включая эту статью, не дают разрешения на клиническую работу. Для лабораторной практики следуйте утвержденной стандартной операционной процедуре лаборатории, согласованной с актуальными документами CDC, APHL или CLSI; справочный документ CDC по кислотоустойчивому окрашиванию в архиве Stacks показывает, как такие процедуры определяют реагенты и способы интерпретации. Работа с образцами туберкулеза требует мер сдерживания: мазки готовят в боксе биологической безопасности, поскольку подготовка создает аэрозоли и брызги, а руководство CDC по лабораторной безопасности указывает, что даже термофиксированные мазки могут содержать жизнеспособные туберкулезные бациллы и все равно должны рассматриваться как загрязненные. Запись CDC Public Health Image Library о мазке с карболовым фуксином и метиленовым синим, исследованном на M. leprae служит полезным напоминанием о диапазоне применения метода за пределами туберкулеза: тот же красно-синий контраст используется везде, где ищут кислотоустойчивые организмы, а аккуратный отрицательный результат сам по себе является результатом, который следует фиксировать.

Чтение готового препарата

Контрастный краситель оправдывает свое применение во время скрининга. Микроскопист, просматривающий препарат при малом увеличении, сначала использует синий фон для оценки качества мазка: равномерность распределения клеток, наличие сохраненных клеток хозяина для фокусировки, отсутствие плотного осадка. Затем красные объекты привлекают внимание именно потому, что на препарате больше ничего не является красным. Подтверждение выполняется при иммерсионном увеличении, где настоящие бациллы имеют ожидаемый вид тонких, иногда слегка изогнутых или бусинчатых палочек, а не равномерных частиц красителя.

Фоновое окрашивание также определяет формулировки отчета. Мазок с красными бациллами описывают как кислотоустойчивые бациллы обнаружены, часто с полуколичественной оценкой по шкале лаборатории. Мазок без красных организмов описывают как кислотоустойчивые бациллы не обнаружены, а не как отрицательный на туберкулез. Различие важно, поскольку синее поле подтверждает, что окрашивание сработало, клетки восприняли контрастный краситель и оптика была достаточной, но ничего не говорит об организмах ниже предела обнаружения. Пустое синее поле является достоверным результатом о препарате, а не выводом о пациенте.

Помните о распределении функций, и отчеты становятся понятными. Карболовый фуксин обнаруживает кандидатов. Кислый спирт выполняет проверку. Метиленовый синий только делает ответ читаемым: красный удержал краситель в условиях воздействия кислоты, синий потерял его. Все остальное — вид, количество и клиническое значение — требует работы за пределами одного препарата.