Окрашивание клеток щеки метиленовым синим: что наблюдать

Ученик помещает каплю суспензии клеток щеки на предметное стекло, смотрит в микроскоп и почти ничего не видит. Несколько бледных призраков дрейфуют в ярком поле. Он регулирует фокус, затем добавляет больше света и делает вывод, что стекло пустое. Стекло не пустое. Клетки есть. Они почти прозрачны, и именно прозрачность является главной проблемой, которую существует этот краситель решает.

Это несоответствие между ожиданием и изображением стоит обозначить до начала протокола. Новички ожидают, что микроскоп покажет детали так же, как камера с увеличением показывает удалённую вывеску. Светлопольный микроскоп делает более узкую вещь: он показывает различия в поглощении света. Неокрашенная клетка щеки почти не поглощает свет, поэтому создаёт почти никакого различия. Метиленовый синий добавляет это различие. Он связывается внутри клетки неравномерно и превращает структуру в контраст. Когда учащиеся понимают эту концепцию, каждый последующий шаг воспринимается как следствие, а не как рецепт.

Здесь полезен общий материал о том, как простые красители добавляют контраст в школьной лаборатории, а повторение настройки светлопольного микроскопа перед окрашиванием помогает избежать половины неудачных препаратов. Химия, лежащая в основе цвета, относится к введению в метиленовый синий в микроскопии, где объясняется, почему именно этот краситель постоянно появляется на лабораторном столе.

Учебный протокол

Вариант влажного препарата ниже является более простым стандартом для обычных занятий. Он не требует пламени и этапа фиксации. Вариант фиксированного мазка, используемый в некоторых университетских руководствах, добавляет воздушную сушку и краткую тепловую фиксацию, как в практической работе North Central Texas College по мазку клеток щеки, опубликованной через Biology LibreTexts, но тепловая фиксация является приёмом микробиологии, а не обязательным условием для наблюдения эпителиальных клеток.

Что нужно: чистые предметные стёкла и покровные стёкла, стерильные одноразовые тампоны (предпочтительно) или новые плоские зубочистки, флакон-капельница с 0,5–1-процентным водным раствором метиленового синего, дистиллированная или деионизированная вода, промокательная бумага, перчатки и световой микроскоп с общим увеличением 100x и 400x.

1. Прополощите рот обычной водой. Это удаляет частицы пищи, которые позже окрашиваются очень интенсивно и отвлекают от клеток.
2. Каждый учащийся берёт образец только со своей щеки. Осторожно потрите внутреннюю поверхность щеки свежим стерильным тампоном. Нажимайте, а не соскабливайте. Остановитесь задолго до появления дискомфорта или кровотечения.
3. Тонко прокатайте тампон по центру чистого предметного стекла. Тонкая плёнка является самым важным фактором, определяющим читаемость препарата. Толстый белый осадок окрасится в неразличимую синюю массу.
4. Добавьте одну каплю метиленового синего на мазок. Оставьте на 1–3 минуты. Одной минуты достаточно во многих университетских протоколах; лабораторное руководство NCERT Class IX по естественным наукам использует около 3 минут для временного препарата. Дольше не значит лучше, и чрезмерное окрашивание является самой распространённой ошибкой по времени.
5. Осторожно промойте дистиллированной водой или удалите излишки красителя промокательной бумагой, следуя местному протоколу. Фон должен стать бледно-синим, а не тёмно-синим.
6. Опустите покровное стекло под углом так, чтобы один край коснулся поверхности первым, затем медленно дайте ему опуститься. Это предотвращает появление пузырьков воздуха.
7. Начните с малого увеличения, чтобы найти клетки, подтвердить фокус и центрирование, затем перейдите к 100x и наконец к 400x. При 400x используйте только тонкую фокусировку.

Концентрация красителя заслуживает одного точного замечания. Школьные протоколы обычно используют около 1 процента водного раствора метиленового синего. Более концентрированный исходный раствор или длительное воздействие быстрее усиливают окраску фона, чем окраску ядра, что нарушает контраст, от которого зависит упражнение.

Безопасная работа с материалом щеки

Образцы щеки содержат слюну и обычные микроорганизмы полости рта, поэтому каждый свежий мазок следует считать потенциально инфекционным материалом, даже если донорами являются здоровые одноклассники. Руководство Американского общества микробиологии по биобезопасности для учебных лабораторий излагает общие принципы: оценивать риск до занятия, носить перчатки, защищать глаза при возможном разбрызгивании, мыть руки после работы, дезинфицировать поверхности и утилизировать загрязнённые одноразовые материалы через утверждённый маршрут биологических отходов.

Четыре правила для занятий покрывают большую часть рисков. Один донор на один тампон и одно стекло, никогда не использовать совместно. Только самостоятельный забор образца, никогда не брать образец у соседа. Одноразовые тампоны и зубочистки сразу отправляются в предназначенный контейнер для отходов, никогда не возвращаются на стол. Сам метиленовый синий окрашивает кожу и одежду и раздражает глаза, поэтому применяются перчатки и обычные правила работы с красителями. Не превращайте это упражнение в выращивание чего-либо из мазка и не выполняйте самостоятельную тепловую фиксацию свежего человеческого материала вне школьной процедуры безопасности.

Что наблюдать и почему это выглядит именно так

При 100x ищите широкие плоские клетки, бледно-синие, с неправильными овальными или многоугольными очертаниями. Они располагаются поодиночке или в виде рыхлых перекрывающихся слоёв. Каждая клетка обычно содержит одно более тёмное синее пятно. Это пятно — ядро. Также обратите внимание на расположение: плоские эпителиальные клетки похожи на тонкие плитки, а не на сферы, поэтому их края выглядят как потрескавшаяся глазурь, а не как круглые воздушные шарики.

При 400x отчётливо видны три признака. Граница клетки выглядит как тонкая более тёмная линия, окружающая клетку. Цитоплазма заполняет внутреннюю часть равномерным светло-синим цветом. Ядро располагается темнее и компактнее, часто имеет овальную форму, обычно находится ближе к центру, но не всегда. Попросите учащихся записать все три признака, а также форму и увеличение, потому что именно это требуется в рабочем листе.

Здесь важен один момент точности, который многие рабочие листы указывают неправильно. Видимая граница соответствует области плазматической мембраны, но сама мембрана — липидный бислой толщиной примерно 7–10 нанометров — намного меньше разрешающей способности школьного микроскопа. То, что видят учащиеся, является оптическим краем клетки плюс накоплением красителя в этой области. То же предостережение относится к органеллам. Митохондрии, эндоплазматический ретикулум, аппараты Гольджи и рибосомы не видны в этом препарате. Обычный световой микроскоп при хороших условиях имеет разрешение примерно до 0,2 микрометра, как объясняется в материале NCBI по инструментам микроскопии в клеточной биологии, а большая часть ультраструктур находится ниже или около этого предела. Более высокое пустое увеличение делает изображение крупнее, но не добавляет деталей.

Почему ядро окрашивается темнее всего? Метиленовый синий является катионным красителем, положительно заряженным в растворе, и связывается с отрицательно заряженным материалом клетки, прежде всего с нуклеиновыми кислотами. Хроматин концентрирует ДНК в ядре, поэтому ядро накапливает больше всего красителя. Цитоплазма также содержит РНК и другие заряженные молекулы, поэтому она тоже окрашивается, но более рассеянно и светлее. Важное уточнение: метиленовый синий не является специфическим красителем ДНК. Работа о распределении метиленового синего при визуализации ядра описывает связывание катиона с областями, богатыми нуклеиновыми кислотами, а более раннее количественное исследование связывания метиленового синего в клеточных препаратах показало, что большая часть связанного красителя связана с нуклеиновыми кислотами. Тёмное ядро плюс светлая цитоплазма — это поэтому контрастный рисунок, а не молекулярный анализ.

Ошибки учащихся и способы их распознавания

Почти каждый неудачный препарат относится к одному из пяти типов. Учите учащихся диагностировать препарат, а не повторять процедуру вслепую.

Чрезмерное окрашивание делает клетки и фон одинаково тёмными, поэтому ядро теряется в поле зрения. Исправление — сократить время окрашивания или тщательнее промыть препарат. Недостаточное окрашивание оставляет призрачные клетки, которые исчезают при увеличении освещения; добавляйте время шагами по тридцать секунд. Толстые мазки создают плотные перекрывающиеся массы, где невозможно проследить контуры; исправление механическое — в следующий раз распределить тоньше, поскольку никакая промывка не спасёт скопление клеток. Пузырьки воздуха выглядят как идеальные круги с чёткими тёмными краями и отвлекают новичков, которые принимают их за структуры; медленно опускайте покровное стекло под углом. Маленькие тёмные точки на клетках или вокруг них обычно являются обычными бактериями полости рта, как отмечают школьные протоколы, например процедура Ingrid Science по клеткам щеки. Они подтверждают наличие микроорганизмов во рту, что может быть запоминающимся для учащихся, но в этом упражнении их нельзя определить до вида и не следует рисовать как части клеток. Частицы пищи и слизистые нити окрашиваются неравномерно и интенсивно; предварительное полоскание существует для их уменьшения.

Что это упражнение не может показать

Это образовательное наблюдение, а не диагностический тест. Ничто во внешнем виде клеток в учебном окрашенном препарате не может диагностировать инфекцию, рак или любое заболевание, и статья не должна восприниматься как утверждение обратного. Препарат показывает форму, границу, цитоплазму и ядро при двух увеличениях. Он не показывает ультраструктуру мембраны, детали органелл или молекулярную идентичность. Явное указание ограничений защищает и науку, и учащихся: хороший результат — это правильно подписанный рисунок с указанными увеличением и красителем, а не вывод о состоянии здоровья.

Рабочий лист для учащихся и подписанные микрофотографии

Два проектных материала для этой страницы — это подписанная микрофотография выше и рабочий лист ниже. Распечатайте рабочий лист по одному экземпляру на учащегося или покажите его на экране и попросите учащихся перенести поля в тетради.

Как использовать его на 45-минутном занятии: десять минут на инструктаж по безопасности и взятие образцов, десять минут на окрашивание и приготовление препарата, пятнадцать минут на наблюдение и зарисовку при обоих увеличениях, десять минут на контрольный список и сравнение с подписанной микрофотографией. Пункты списка намеренно механические. Тонкий мазок, правильное время окрашивания, ядро темнее цитоплазмы, увеличение записано. Учащийся, который может отметить все четыре пункта,