Объяснение щелочного и полихромного окрашивания метиленовым синим по Леффлеру

Три флакона могут стоять рядом на столе для окрашивания, каждый с маркировкой, содержащей какой-либо вариант метиленового синего. На одном написано «водный метиленовый синий 1%». На другом — «щелочной метиленовый синий Леффлера». На третьем — «полихромный метиленовый синий». Занятый сотрудник берёт ближайший. Затем мазок окрашивается слишком слабо, или равномерно в синий цвет, или в неожиданные оттенки фиолетового, и результат списывают на образец.

Это проблема состава, а не образца. Эти три раствора содержат родственные красители, но воплощают разные концепции окрашивания. Один представляет собой простой катионный краситель при близком к нейтральному pH. Второй — тот же краситель, сделанный более активным за счёт щёлочи. Третий уже не является одним красителем вообще, а представляет собой специально окисленную смесь. Использование неправильного варианта меняет принцип окрашивания непосредственно в процессе работы.

Краткий ответ

Обычный водный метиленовый синий — это базовый вариант: около 1% красителя в воде, простой катионный краситель для морфологии бактерий и общей микроскопии. Щелочной метиленовый синий Леффлера содержит небольшое измеренное количество разбавленной щёлочи в спиртовом исходном растворе, разбавленном водой, что повышает pH и усиливает связывание катионного красителя с кислыми структурами бактерий. Полихромный метиленовый синий — это метиленовый синий, который был специально выдержан путём окисления в щелочной среде, поэтому флакон содержит смесь деметилированных гомологов (azure A, azure B, azure C), тионина и метиленового фиолетового наряду с остаточным метиленовым синим, и эта смесь окрашивает разные структуры разными оттенками.

Если запомнить только одно предложение: ощелачивание изменяет интенсивность окрашивания, а полихромирование изменяет цвета окрашивания.

Обычный водный метиленовый синий: точка отсчёта

Самая простая формула — это метиленовый синий, растворённый в воде, обычно в концентрации 1% мас./об., без добавления щёлочи и без окисления. Окрашивающим компонентом является катион метилтиониния с хлоридным противоионом — небольшой плоский фенотиазиновый краситель, описанный в записи метиленового синего в PubChem как хлорид метилтиониния. Как катион он связывается с фосфатными остовами нуклеиновых кислот и кислыми группами на клеточных стенках бактерий, окрашивая клетки в синий цвет на светлом фоне.

Его преимущество — предсказуемость. Ядра и бактерии становятся синими. Контраст умеренный. Слабо выраженные организмы могут окрашиваться недостаточно интенсивно, и именно это ограничение Леффлер стремился устранить. Для более широкого семейства простых бактериальных красителей, к которому относится этот раствор, см. обзор простого окрашивания бактерий. Дисциплина идентификации также важна: methyl blue — это совершенно другая молекула, как объясняется в статье methyl blue versus methylene blue, поэтому поиск в каталоге только по названию цвета может привести к неправильному классу красителя.

Щелочной метиленовый синий Леффлера: тот же краситель, но усиленный

Классический состав Леффлера объединяет спиртовой исходный раствор метиленового синего с разбавленной щёлочью в воде. В учебных вариантах используется 0,3 г красителя в 30 мл 95% этанола плюс 100 мл 0,01% водного гидроксида калия (или эквивалентно 30 мл насыщенного спиртового метиленового синего, 100 мл дистиллированной воды и 1 мл 1% KOH), что даёт рабочий раствор с содержанием около 0,3% красителя при выраженно щелочном pH. Коммерческие варианты следуют тому же принципу, и каталог микробиологических красителей Thermo Fisher перечисляет щелочной метиленовый синий Леффлера наряду с полихромными и водными вариантами как отдельные каталожные позиции с отдельными назначениями.

Щёлочь — это основная идея метода. Повышение pH депротонирует карбоксильные и фосфатные группы в образце, увеличивая плотность отрицательных участков, тогда как спиртовой исходный раствор сохраняет краситель полностью растворённым, поэтому он поступает к этим участкам в мономерной форме. В результате бактерии окрашиваются быстрее и интенсивнее, чем при использовании нейтрального водного красителя, с характерными тёмно-синими палочками и кокками обычного бактериологического мазка. Время окрашивания обычно составляет от одной до трёх минут с последующей промывкой водой.

Классическое применение — Corynebacterium diphtheriae, выращенная на сывороточной среде Леффлера: тонкие, часто булавовидные палочки с интенсивно окрашенными метахроматическими гранулами Бабеша–Эрнста из запасного полифосфата. Сочетание среды и красителя имеет историческое значение, поскольку оба связаны с одним и тем же бактериологом, а контраст гранул является основным результатом. Помимо работы с дифтерией, краситель используется как общий бактериологический краситель для мазков из культур, для морфологии Neisseria в клинических мазках и в случаях, когда окрашивание по Граму не требуется, но обычный водный синий даёт слишком слабое окрашивание. Это монохромное окрашивание. Всё кислое получает какой-либо оттенок синего. Когда протокол требует дифференциации по цвету, одной щёлочи недостаточно.

Практическое предостережение: щелочные растворы красителей разрушаются и образуют осадок при хранении и поглощении углекислого газа. Лаборатории либо готовят небольшие объёмы, либо покупают каталожный раствор и соблюдают срок хранения, вместо того чтобы использовать старый флакон, который теперь переносит осадок на каждый предметный стекло.

Полихромный метиленовый синий: одно название, несколько красителей

Полихромный метиленовый синий начинается с того же красителя, но подвергается контролируемому окислению в щелочной среде, которое исторически называли созреванием или полихромированием. Щелочное старение, нагревание с карбонатом или окисление такими агентами, как дихромат, постепенно удаляют метильные группы из диметиламино заместителей. Продукт представляет собой смесь: остаточный метиленовый синий плюс azure B (потерян один метил), azure A и azure C (дальнейшее деметилирование), тионин (полностью деметилированный) и окислительные побочные продукты семейства метиленового фиолетового. Каждый компонент имеет собственный оттенок и сродство к тканям, поэтому смесь окрашивает метахроматически: ядра, гранулы, муцины и хрящи приобретают различные синие и красно-фиолетовые оттенки.

Эта химия лежит в основе известных кровяных красителей. Ранние исследователи обнаружили, что ощелаченный метиленовый синий окрашивает ядра паразитов малярии в фиолетовые оттенки, но их водные созревшие растворы были нестабильными и выпадали в осадок через несколько дней. Обзор how the purple blood stain was invented описывает, как Маляховский и Романовский независимо использовали этот эффект в 1891 году, как метанол был введён для стабилизации осадка красителя и фиксации плёнок без нагревания, и как позднее Гимза стандартизировал смесь вокруг измеренных azure B и эозина со стабилизацией глицерином. Современные красители типа Гимзы напрямую происходят от полихромного метиленового синего плюс эозина — сочетания, создающего эффект Романовского. Для подробностей о сочетании с эозином и компоненте azure B см. Romanowsky-type stains and the azure B eosin interaction.

Поскольку это смесь, полихромный метиленовый синий по своей природе является наименее стандартизированным из трёх вариантов. Точный баланс оттенков зависит от способа и степени окисления, поэтому поставщики гистологических материалов продают его как отдельный продукт с собственным контролем характеристик, а не как состарившийся метиленовый синий Леффлера. Типичные применения включают метахроматическое выявление гранул тучных клеток, муцинов и хрящевой ткани, детализацию плазматических клеток и Helicobacter pylori в срезах тканей методами полихромного окрашивания типа Goodpasture. Это правильный выбор, когда требуется различение по цвету, и неправильный выбор, когда протокол ожидает чистый монохромный силуэт бактерий.

Сравнение состава и назначения

Рассматривайте таблицу как процедуру выбора. Если образец окрашивается слишком слабо, измените концепцию pH и выберите Леффлера. Если всё окрашивается, но ничто не различается, измените концепцию красителя и выберите полихромный вариант. Если мазок Леффлера показывает красивые гранулы, но руководитель спрашивает, почему ядра и цитоплазма имеют один синий цвет, ответ заключается в том, что ни один щелочной монохромный краситель не может выполнить эту задачу. Этот вопрос относится к полихромному семейству и его производным кровяных красителей.

Избежание стандартных ошибок смешения

Две ошибки являются причиной большинства недоразумений. Первая — считать Леффлера взаимозаменяемым с обычным метиленовым синим, потому что оба выглядят синими во флаконе. Они различаются по pH и интенсивности, и замена нейтрального красителя там, где указан Леффлер, устраняет именно тот контраст гранул, ради которого был создан протокол. Вторая — считать любой старый или случайно состарившийся щелочной синий полихромным. Неконтролируемое старение создаёт неизвестную смесь неизвестной концентрации, тогда как настоящие полихромные растворы готовятся по определённым схемам окисления и, в случае линии кровяных красителей, сочетаются с измеренным количеством эозина. История показывает важный урок: нестабильные водные созревшие растворы 1890-х годов уступили место стабилизированным метанольным формулам именно потому, что неконтролируемые смеси нельзя было воспроизвести — это стоит помнить перед окрашиванием диагностического стекла из флакона неизвестного возраста.

Точность названий завершает процесс. Проверяйте каталожный продукт (водный, Леффлера или полихромный), содержание красителя и предполагаемое применение по этикетке, а не делайте вывод только по цвету. У трёх формул есть общий предшественник-хромофор. Но назначение у них разное.