Новый метиленовый синий и окраска ретикулоцитов: отдельный краситель и метод для живых клеток

Студент готовит подсчёт ретикулоцитов, заказывает метиленовый синий, смешивает его с кровью и почти ничего не видит. Однокурсник использует флакон с маркировкой «новый метиленовый синий» и получает чёткие синие нити внутри части эритроцитов. Первый студент предполагает, что второй флакон свежее или более концентрированный. Ни то ни другое. В нём содержится другая молекула.

Именно эта ошибка в понимании лежит в основе большинства заблуждений в этой области. Название предполагает, что новый метиленовый синий — это улучшенная партия метиленового синего. Химия говорит об обратном. Новый метиленовый синий N является отдельным фенотиазиновым красителем со своим номером Colour Index, собственной схемой замещения и стандартизированной ролью в гематологии. После того как это различие становится понятным, остальная часть метода (почему клетки должны быть живыми во время окрашивания, что считается ретикулоцитом, какое место занимают тельца Гейнца и когда появляется бриллиантовый крезиловый синий) становится простой.

Краткий ответ

Новый метиленовый синий N, гематологический реагент, обычно идентифицируется как Basic Blue 24 в записи PubChem для нового метиленового синего, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, формула C18H22ClN3S. Обычный метиленовый синий — это хлорид метилтиониния, Basic Blue 9, в записи PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, формула C16H18ClN3S. Структурно новый метиленовый синий содержит две метильные группы в кольце и этиламино-боковые цепи, тогда как метиленовый синий содержит диметиламиногруппы. Это различие меняет особенности окрашивания. В учебниках по гематологии обычный метиленовый синий описывается как относительно слабый краситель для ретикулоцитов, а новый метиленовый синий — как более глубокий и равномерный, что обобщено в теме ScienceDirect о новом метиленовом синем.

Да, новый метиленовый синий является суправитальным красителем. Суправитальное окрашивание означает окрашивание живых клеток после их извлечения из организма и до фиксации, как определено в обзоре NCBI по принципам суправитального окрашивания. И новый метиленовый синий, и бриллиантовый крезиловый синий относятся к этой категории, а стандарт CLSI для ретикулоцитов прямо рассматривает новый метиленовый синий как суправитальный краситель. Студенты иногда связывают это с окраской по Романовскому фиксированных мазков. Эта модель мышления здесь не работает. Сначала зафиксируйте — и метод перестанет работать.

Для читателей, разбирающихся в похожих названиях красителей, метиловый синий против метиленового синего описывает другую и более широкую путаницу между анионным триарилметановым красителем и катионным семейством фенотиазинов. Обзор лабораторных окрашиваний помещает суправитальные методы среди методов с фиксированными плёнками, а руководство по морфологии клеток крови показывает место оценки ретикулоцитов в более широком дифференциальном анализе.

Предупреждение для каталогов: отдельная форма двойной соли нового метиленового синего с хлоридом цинка существует под CAS 6586-05-6. Поэтому в разделе методов следует указывать форму соли и поставщика, а не только общее название.

Что на самом деле делает суправитальное окрашивание

Ретикулоцит — это молодой эритроцит, который потерял ядро, но сохраняет остаточную рибосомальную РНК. В неокрашенном влажном препарате эта РНК невидима. Суправитальный краситель проникает в живую клетку и осаждает или агрегирует эту РНК в виде синих гранул и нитей — ретикулофиламентозного материала, видимого под масляной иммерсией. Таким образом, сеть является продуктом окрашивания, а не готовым каркасом, ожидающим появления цвета. Поэтому параметры протокола (концентрация красителя, буфер, соотношение крови и красителя, температура, время) имеют такое же значение, как и название красителя.

Практическое следствие — строгий порядок действий: сначала смешивают антикоагулированную кровь с красителем, инкубируют, затем готовят мазки и исследуют их без фиксации и без контрастной окраски. Фиксация до окрашивания или контрастный краситель, скрывающий слабые нити, уничтожают информацию, от которой зависит подсчёт.

Рабочий протокол окраски ретикулоцитов новым метиленовым синим

Не существует единственной универсальной формулы, поэтому необходимо указывать использованный вариант. Три документированных варианта показывают диапазон.

Классическая процедура типа Brecher использует примерно 0,5% новый метиленовый синий с оксалатом калия, смешанный в равных объёмах с хорошо перемешанной кровью с ЭДТА, с инкубацией около 10–15 минут при комнатной температуре. После осторожного перемешивания готовят тонкие клиновидные мазки, высушивают на воздухе и исследуют без фиксации под масляным объективом 100x. Процедура NCBI для подсчёта ретикулоцитов описывает этот процесс и используемую при нём схему подсчёта.

Вариант Dacie и Lewis использует 1,0% новый метиленовый синий в цитратно-солевом растворе, смешанный с 2–4 объёмами крови и выдержанный при 37 C в течение 15–20 минут перед приготовлением мазков. Недавняя реализация гармонизированного варианта процедуры CLSI H44 использовала менее концентрированный 0,1% раствор в фосфатно-буферном солевом растворе при pH 7,4, с инкубацией при 20 C в течение 10 минут без фиксации, как сообщается в исследовании гармонизации NMB 2026 года.

Правила подсчёта одинаковы для разных вариантов. Клетку оценивают как ретикулоцит, если она содержит как минимум две отдельные синие окрашенные гранулы или сегмента нити, что исключает единичный осадок красителя. В обычной работе подсчитывают не менее 1 000 эритроцитов и указывают ретикулоциты в процентах. При низких значениях необходимо больше клеток. Обзор методологии CLSI H44 отмечает, что при примерно 1% ретикулоцитов требуется около 4 400 клеток для снижения вариации подсчёта до 5%, в обзоре CLSI H44 в De Gruyter. Окуляр Миллера делает большие подсчёты более практичными. Фильтруйте или свежеприготовляйте краситель, поскольку осадок имитирует включения.

Тельца Гейнца в том же препарате

Тот же суправитальный мазок может также демонстрировать тельца Гейнца, которые представляют собой агрегаты окисленного и денатурированного гемоглобина, а не остаточную РНК. В препаратах с новым метиленовым синим они выглядят как округлые тела, часто одиночные и расположенные рядом с мембраной, окрашенные в более светлый синий цвет, чем ретикулофиламентозный материал. Они плохо сохраняются при фиксации и контрастном окрашивании, поэтому следует исследовать нефинированный препарат. Недавний протокол с использованием 20 микролитров крови с ЭДТА, 20 микролитров 1% нового метиленового синего и 15 минут инкубации количественно оценивал клетки с тельцами Гейнца среди 250 эритроцитов в исследовании PMC с описанием этой процедуры.

Два различия предотвращают ошибочную интерпретацию. Во-первых, метиловый фиолетовый и кристаллический фиолетовый окрашивают тельца Гейнца интенсивнее, чем новый метиленовый синий, как отмечено в теме ScienceDirect о тельцах Гейнца. Новый метиленовый синий является удобным выбором, когда одновременно оцениваются ретикулоциты и тельца Гейнца, но не самым сильным специализированным красителем для телец Гейнца. Во-вторых, включения HbH при альфа-талассемии дают многочисленные мелкие точки по всей клетке после суправитального окрашивания, тогда как классические тельца Гейнца встречаются реже, крупнее и часто связаны с мембраной. Осадок красителя — третий имитатор: он находится вне плоскости фокусировки клеток и изменяется между полями.

Бриллиантовый крезиловый синий против нового метиленового синего

Оба красителя являются суправитальными красителями для ретикулоцитов, но стандартизация отдаёт предпочтение одному из них. Метод ретикулоцитов CLSI H44-A2, разработанный совместно с International Council for Standardization in Haematology и указанный на странице стандарта CLSI H44, обозначает окраску крови с ЭДТА новым метиленовым синим как ручной сравнительный метод. Классическое преподавание гематологии совпадает в описании внешнего вида: новый метиленовый синий даёт более глубокое и равномерное окрашивание нитей, тогда как бриллиантовый крезиловый синий сильнее зависит от партий и образцов.

Этот статус требует уточнения. Руководство ICSH по оценке анализаторов принимает ручную микроскопию с новым метиленовым синим как сравнительный эталонный подход, но отмечает её субъективность и относительную неточность, при этом при наличии возможностей предпочтение отдаётся протоколам с проточной цитометрией. Сравнение 100 образцов в 2022 году обнаружило меньший сдвиг относительно анализатора при использовании бриллиантового крезилового синего, чем нового метиленового синего, что описано в сравнении методов окрашивания PMC. Обоснованное резюме для студентов: используйте новый метиленовый синий как стандартизированный ручной сравнительный метод, проверяйте любой локальный метод с бриллиантовым крезиловым синим относительно него или автоматизации и ожидайте большего разброса при ручной микроскопии в любом случае. Более ранняя литература по стандартизации также рекомендовала очищенный Azure B как химически более чистую альтернативу, поскольку коммерческие партии красителей различались, что объясняет, почему качество реагентов всё ещё обсуждается в методических разделах, в исследовании Marshall по Azure B.

Избегание стандартных ошибок

Четыре ошибки объясняют большинство неудачных препаратов. Заказ обычного метиленового синего вместо нового метиленового синего N приводит к слабому окрашиванию из-за химических свойств, а не из-за техники. Фиксация или контрастное окрашивание до просмотра удаляют суправитальный сигнал. Подсчёт осадка красителя как гранул завышает результат, чего позволяют избежать правило двух гранул и фильтрованный краситель. Подсчёт слишком малого числа клеток при низком проценте ретикулоцитов создаёт число, выглядящее точным, но имеющее широкие пределы неопределённости. У каждой ошибки один и тот же признак: микроскопист обвиняет микроскоп в том, что было определено этапом работы с реагентом.