Метиленовый синий, Nrf2 и биогенез митохондрий: что было измерено и что всё ещё предполагается

Одно предложение часто встречается в материалах о метиленовом синем: он активирует Nrf2 и создаёт новые митохондрии. Это предложение выглядит как одно утверждение, но на самом деле содержит две разные концепции, изученные в разных системах и подтверждённые разными видами доказательств. Первая — это сигнальный путь, сенсор, который включает защитные гены. Вторая — это строительная программа, в рамках которой клетка создаёт больше митохондриального аппарата. Сигнал может запустить строительство, но доказательство того, что сигнал сработал, не является доказательством того, что здание построено, а наличие большего количества строительного материала не означает наличие лучшего источника энергии. Эта статья разделяет эти три понятия.

Концепция Nrf2: сенсор, а не щит

Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2) — это транскрипционный фактор, белок, задача которого заключается во включении генов. В состоянии покоя он удерживается в цитоплазме сенсорным белком Keap1, который передаёт его системе утилизации клетки для постоянного разрушения. Когда окислители или электрофилы изменяют реактивные цистеины на Keap1, процесс утилизации прекращается. Новосинтезированный Nrf2 накапливается, перемещается в ядро, соединяется с малыми белками Maf и связывается с последовательностями ДНК, называемыми элементами антиоксидантного ответа. Это связывание включает набор защитных генов.

Канонические показатели этого пути являются специфическими. NQO1 (NAD(P)H quinone dehydrogenase 1) и TrxR1 (thioredoxin reductase 1) относятся к наиболее надёжным генам-мишеням Nrf2. HO-1 (heme oxygenase-1) сильно индуцируется, но также регулируется другими факторами. Ферменты вроде SOD и каталазы являются частью антиоксидантного аппарата, однако их уровни контролируются множеством транскрипционных факторов, поэтому повышение SOD само по себе не доказывает, что причиной был Nrf2. Доказательства, наиболее близкие к самому сигнальному событию, — это накопление ядерного Nrf2, активация ARE-репортера или индукция канонических мишеней, которая исчезает после удаления Nrf2. Всё остальное — снижение уровня окислителей, улучшение выживания при стрессе, повышение глутатиона — является нисходящим эффектом, который могут создавать многие пути.

Первый результат с метиленовым синим в этой истории находится ближе к концу этой шкалы. Фибробласты, подвергшиеся воздействию наномолярного метиленового синего, показали замедленное старение клеток одновременно с повышенным содержанием комплекса IV, увеличенным потреблением кислорода и индукцией ферментов второй фазы TrxR1 и NQO1, как сообщалось в исследовании, которое впервые связало метиленовый синий с усилением митохондрий и задержкой старения. TrxR1 и NQO1 — именно те канонические мишени Nrf2, которые хочет увидеть внимательный читатель. Однако исследование не показало сам сигнальный процесс: не было измерения ядерного Nrf2, ARE-репортера или контроля с удалением Nrf2. Поэтому корректное прочтение заключается в том, что метиленовый синий индуцирует известные мишени Nrf2 в этой системе, что согласуется с активацией Nrf2, но не выделяет Nrf2 как причину. Индукция гена-мишени происходит на один шаг ниже переключателя.

Концепция биогенеза: программа с тремя контрольными точками

Биогенез митохондрий — это программа, посредством которой клетка создаёт больше митохондриальной мощности. Её классическая иерархия проходит через три контрольные точки. Во-первых, коактиватор PGC-1alpha включает программу. Во-вторых, ядерные транскрипционные факторы (что может создавать путаницу: один из них называется NRF1, nuclear respiratory factor 1, и это другой белок, не Nrf2) запускают экспрессию митохондриальных генов, включая TFAM, который поддерживает и реплицирует митохондриальную ДНК. В-третьих, клетка получает больше митохондриальных геномов и больше дыхательного аппарата, что можно измерять по числу копий mtDNA, активности цитратсинтазы или количеству и активности дыхательных комплексов.

Каждая контрольная точка представляет собой более слабое или более сильное утверждение, чем предыдущая. Повышение PGC-1alpha или матричной РНК TFAM показывает, что программа была запрошена, но не что она завершилась. Большее количество mtDNA или больше белка комплекса IV показывает наличие большего количества материала, но перестроенные митохондрии могут выглядеть так же. Улучшенное дыхание, повышенное потребление кислорода или активность комплекса показывают изменение функции, но функция может улучшиться и без появления новых митохондрий. Сильное утверждение о биогенезе объединяет все три элемента: регулятор, содержание и функцию.

Продолжение исследования на фибробластах прошло большую часть этой цепочки. В человеческих клетках IMR90, обработанных 100 наномолярным метиленовым синим, соотношение NAD к NADH временно увеличилось в течение 15 минут и вернулось к исходному уровню в течение суток. За этим временным энергетическим сигналом последовало временное фосфорилирование энергетического сенсора AMPK, затем индукция PGC-1alpha и SURF1 — белка, необходимого для сборки работающего комплекса IV. Активность комплекса IV примерно удвоилась, количество клеточных окислителей снизилось примерно на 28 процентов, а теломеры разрушались медленнее. Полная последовательность описана в исследовании, связывающем окислительно-восстановительную активность метиленового синего с AMPK и биогенезом митохондрий.

Две детали этой статьи заслуживают внимания, поскольку именно такие детали обычно теряются. Во-первых, значение имел характер реакции, а не просто её наличие: метиленовый синий временно активировал AMPK, тогда как контрольный препарат AICAR активировал его хронически, и временный активатор задерживал старение примерно в восемь раз эффективнее. Поэтому утверждение вида «метиленовый синий активирует AMPK» является неполным; более точное утверждение заключается в том, что он временно активирует AMPK, а сравнение показывает, что хроническая активация выполняет другую работу. Во-вторых, метиленовый синий не изменял клеточный цикл, что исключает наиболее простое альтернативное объяснение: клетки просто делились медленнее и поэтому выглядели моложе.

Ветка на мышах: поведение, геномы и намеренно парадоксальный триггер

Работа на клеточных культурах была расширена до животных группой, изучавшей мышей среднего возраста. После 60 дней перорального применения метиленового синего обработанные мыши сохраняли больше физической выносливости и исследовательского поведения и демонстрировали меньше тревожноподобного поведения по сравнению с необработанными стареющими мышами. В тканях мозга гены, подавленные старением, NRF1, TFAM, SOD2 и субъединица комплекса IV COX1, были восстановлены до уровней, близких к взрослым, а количество копий mtDNA увеличилось. Эти результаты — поведение плюс регулятор плюс количество геномов — представлены в исследовании мышей среднего возраста о метиленовом синем и биогенезе митохондрий мозга.

Интересная часть заключается в предполагаемом триггере, поскольку он противоречит простой истории о том, что метиленовый синий является антиоксидантом. У обработанных мышей наблюдалось повышение образования активных форм кислорода в митохондриях мозга, в частности перекиси водорода. Предложение авторов: именно слабый сигнал перекиси активирует путь Nrf2, который затем запускает программу биогенеза. В этой модели метиленовый синий является прооксидантом на этапе запуска и антиоксидантом на этапе результата — паттерн, который фармакологи называют гормезисом, когда небольшой стресс вызывает защитный ответ, превышающий сам стресс. Было ли это повышение перекиси причиной активации Nrf2, напрямую не проверялось; это предполагаемая связь, а не измеренное звено.

Сопутствующее исследование той же группы проверило аспект безопасности этой гипотезы. В изолированных митохондриях мозга метиленовый синий повышал образование перекиси водорода при концентрациях всего 50 наномоляр, однако терапевтические концентрации не вызывали обнаруживаемого повреждения митохондриальной ДНК. Только при 100 микромоляр, значительно превышающих терапевтические уровни, отдельные фрагменты mtDNA демонстрировали повреждение, а сочетание 20 микромоляр красителя с красным светом создавало синглетный кислород, который широко повреждал mtDNA, что является известным фотосенсибилизирующим поведением красителя, а не его фармакологией в темноте. Предварительная обработка даже защищала митохондрии вентрального среднего мозга от вызванных ротеноном повреждений mtDNA. Дозовая зависимость и контроль генотоксичности подробно описаны в исследовании непрерывного образования перекиси без генотоксичности при использовании метиленового синего.

Измеренное против предполагаемого: чтение схемы

Схема пути ниже была создана для этой статьи, чтобы закрепить различие, которое текст проводил ранее. Блоки со сплошными границами — это этапы с прямой экспериментальной поддержкой в литературе о метиленовом синем: окислительно-восстановительный цикл, изменяющий NAD/NADH, временное фосфорилирование AMPK, индукция PGC-1alpha и SURF1, повышение активности комплекса IV, индукция NQO1 и TrxR1, восстановление экспрессии генов биогенеза и числа копий mtDNA в мозге мышей, а также повышение перекиси без повреждения mtDNA при терапевтических дозах. Блоки с пунктирными границами — это предполагаемые связи: восприятие сигнала перекиси белком Keap1, накопление Nrf2 в ядре и причинная стрелка от активации Nrf2 к программе биогенеза. Эти пунктирные этапы правдоподобны, согласуются с данными и соответствуют стандартной биологии, но в этих исследованиях они не были измерены с помощью контролей (ядерный Nrf2, ARE-репортеры, нокаут Nrf2), которые позволили бы перевести их в сплошные блоки.

Три заблуждения становятся заметными, когда схема находится перед глазами. Во-первых, NRF1 и Nrf2 — разные белки с почти одинаковыми названиями; исследование на мышах измеряло nuclear respiratory factor 1, регулятор биогенеза, а не антиоксидантный транскрипционный фактор, и смешение этих понятий сводит всю схему к одной точке. Во-вторых, экспрессия генов — это начало истории, а не конец; восстановленные сообщения TFAM или COX1 поддерживают запрос на биогенез, тогда как число копий mtDNA и активность комплекса IV являются доказательствами выполнения этого запроса. В-третьих, антиоксидантный результат не доказывает путь через Nrf2; снижение окислителей на 28 процентов в фибробластах и защита от ротенона у мышей являются реальными нисходящими эффектами, но несколько путей сходятся на них.

Что могло бы превратить пунктирный блок в сплошной

Недостающие эксперименты являются стандартными. Измерение ядерного белка Nrf2 после воздействия метиленового синего с временной шкалой, соответствующей временному сигналу AMPK, проверило бы, действительно ли две ветви активируются одновременно, как утверждает гипотеза синхронизированной активации. ARE-репортер подтвердил бы транскрипционную активность вместо вывода по генам-мишеням. Повторение измерений биогенеза с подавлением или удалением Nrf2 проверило бы причинную стрелку напрямую: если индукция комплекса IV и увеличение mtDNA сохраняются без Nrf2, связь неверна, а эффект переносится только через ветвь AMPK. На уровне животных исследование с длительным применением и теми же тремя контрольными точками — регулятор, содержание, функция — проверило бы, сохраняется ли программа или происходит адаптация. До этого момента синхронизированная активация энергетических и защитных путей остаётся тем, чем её назвали авторы: возможным ключевым фактором, а не установленным механизмом.

Читателям, интересующимся более широким фармакологическим контекстом, могут быть полезны дополнительные материалы: как метиленовый синий переносит электроны на уровне митохондрий, какие ещё эффекты он оказывает на митохондрии и клеточную энергию, где результаты о старении клеток находятся в исследованиях старения, как утверждения о биогенезе связаны с когнитивной производительностью, а также данные по безопасности, которые определ