Метиленовый синий для окрашивания ДНК и РНК: гели и применение на мембранах

Студент запускает агарозный гель, окрашивает его метиленовым синим и не видит ничего там, где ожидалась яркая полоса. В соседней зоне постдок окрашивает той же синей бутылкой Northern-мембрану и получает четкие рибосомальные полосы за три минуты. Студент делает вывод, что гель не сработал. Гель не был неисправен. Задачи были разными, и один и тот же краситель отвечает на них с разной чувствительностью, разным фоном и разными правилами дальнейших действий.

Окрашивание ДНК метиленовым синим и окрашивание РНК метиленовым синим используют одинаковую химию, но имеют разные цели. В геле краситель показывает, сколько нуклеиновой кислоты находится внутри пористой матрицы. На мембране он показывает, прошел ли перенос и были ли дорожки загружены равномерно. После понимания этого различия протоколы, пределы обнаружения и ограничения совместимости становятся понятными.

Краткий ответ

Метиленовый синий — это плоский катионный краситель, который нековалентно и обратимо связывается с нуклеиновыми кислотами через сочетание электростатического притяжения к фосфатам, интеркаляции между парами оснований и ассоциации с малой бороздкой. Обратимость является ключевым свойством. Полосы можно окрасить при видимом свете, задокументировать, а затем обесцветить или очистить для клонирования, гибридизации или повторного зондирования.

Для окрашивания агарозного геля метиленовым синим с двухцепочечной ДНК стандартный быстрый рецепт — 0,02 процента мас./об. (200 микрограммов на мЛ) в воде, около 15 минут окрашивания и около 15 минут обесцвечивания водой, с просмотром на белом световом столе. Для мембран классический рецепт Northern-блота — 0,02–0,04 процента красителя в ацетате натрия около pH 5,2, несколько минут окрашивания после переноса и иммобилизации, затем промывка водой и полное обесцвечивание перед гибридизацией. Чувствительность умеренная: десятки–сотни нанограммов на полосу геля при хороших условиях, а консервативные руководства указывают 0,5–1 микрограмм. Это на порядки выше, чем у этиленбромида и красителей SYBR. На мембранах не существует единого полезного предела обнаружения отдельного транскрипта, поскольку окрашивание в основном показывает обильную рибосомальную РНК и общий загруженный материал. Не заменяйте ни один из этих рецептов раствором добавки для розничной продажи. Валидированные методы предполагают аналитический класс красителя, определенные буферы и условия без РНКаз, когда используется РНК.

Как работает связывание и где оно может вводить в заблуждение

Полезная модель состоит из трех частей. Во-первых, положительно заряженная кольцевая система притягивается к отрицательно заряженному фосфатному остову. Спектроскопические исследования показывают, что этот электростатический компонент доминирует при низкой концентрации соли, тогда как моделирование и молекулярная динамика сохраняют интеркаляцию и связывание с малой бороздкой как стабильные режимы для двухцепочечной ДНК, что описано в спектроскопическом исследовании связывания метиленового синего с ДНК. Во-вторых, существует некоторая предпочтительность к GC, причем моделирование указывает на предпочтение шагов CpG и GpC, а эксперименты сообщают о преимущественной ассоциации с GC-богатыми дуплексами в работе о предпочтениях интеркаляции метиленового синего, однако AT-дуплексы также связываются. Обычное окрашивание не является специфичным к последовательности. В-третьих, одноцепочечная ДНК и РНК связываются главным образом посредством электростатики и стекинга с доступными основаниями и участками дуплексов, поэтому интенсивность окрашивания зависит от длины, последовательности и вторичной структуры.

Следуют два вывода. Поскольку связывание нековалентное, краситель вымывается. Полосы в полиакриламидном геле быстро бледнеют, если их специально не фиксировать, и отдельный вариант постоянной фиксации существует именно потому, что обычное окрашивание является временным, как описано Soto и Draper для PAGE-гелей. Поскольку краситель является фотосенсибилизатором, длительное яркое освещение окрашенной ДНК в присутствии кислорода может окислять гуанин и в конечном итоге разрывать цепи — механизм подробно описан в работе о окислении гуанина, сенсибилизированном метиленовым синим. Краткий просмотр при белом свете позволяет избежать хорошо известного повреждения УФ-светом в классических протоколах с этиленбромидом, и это преимущество действительно важно для препаративного выделения. Видимый свет мягче, но не безвреден. Сокращайте время освещения, если ДНК будет клонироваться. О более широкой фотохимии, лежащей в основе этого предупреждения, см. два пути фотохимии метиленового синего. О редокс-паре и состояниях заряда, объясняющих, почему окисленная форма связывается, а восстановленная — нет, см. химию структуры и свойств метиленового синего.

Задача первая: окрашивание внутри гелей

Окрашивание геля отвечает на один вопрос: достаточно ли нуклеиновой кислоты в этой полосе, чтобы ее увидеть невооруженным глазом. Двухцепочечная ДНК в агарозе — наиболее изученный случай. Оригинальный метод окрашивания агарозного геля метиленовым синим Флореса и коллег подтвердил быстрый протокол с 0,02 процента на 1-процентном агарозном геле и показал успешное последующее выделение и клонирование. Тот же протокол поставщика приведен на странице продукта метиленового синего IBI Scientific, где рецепты для мембран с 0,04 процента и быстрого окрашивания геля представлены рядом.

Практический рабочий процесс:

1. Запустите гель обычным способом. Окрашивайте после электрофореза, а не во время него, если перенос или разрешение не были валидированы для измененного метода.
2. Погрузите в 0,02 процента мас./об. метиленового синего в дистиллированной воде при мягком перемешивании примерно на 15 минут.
3. Обесцвечивайте несколькими сменами воды, около 15 минут всего, пока фон матрицы не уменьшится и полосы не станут заметными.
4. Немедленно сфотографируйте на белом световом источнике.

Агароза и полиакриламид ведут себя по-разному. Агароза удерживает краситель в матрице, поэтому обесцвечивание является медленным этапом. Тонкие полиакриламидные гели окрашиваются быстро, но также быстро теряют краситель, что помогает препаративному вырезанию и ухудшает архивное хранение. Синтетические олигонуклеотиды в полиакриламиде можно обнаруживать тем же рецептом 0,02 процента за 20–30 минут с повторными промывками водой, следуя установленным методам PAGE в стиле Current Protocols. Очень разбавленные варианты около 0,0002 процента в разбавленном TBE были описаны для препаративных олигонуклеотидов в течение нескольких часов, но база доказательств слабее.

ДНК и РНК имеют значение. Двухцепочечная ДНК дает наиболее сильное структурированное связывание. РНК и одноцепочечная ДНК окрашиваются, но слабее и менее предсказуемо. Для РНК-гелей с формальдегидом большинство лабораторий пропускают окрашивание синим внутри геля и сначала переносят РНК на мембрану. Это заменяет слабый сигнал в геле на более четкий сигнал на мембране плюс контроль загрузки.

Задача вторая: окрашивание на мембранах

Окрашивание мембраны отвечает на другой вопрос: прошел ли перенос и сопоставимы ли дорожки. Классическое применение — обратимое окрашивание Northern-блота по Herrin и Schmidt, изначально 0,04 процента красителя в 50 мМ ацетата натрия при pH 5,0 в течение 2–3 минут с промывкой водой, удаляемое разбавленным SDS в SSPE перед гибридизацией.

Широко используемый современный вариант выглядит так:

1. Перенесите РНК или денатурированную ДНК на нейлон или нитроцеллюлозу, затем иммобилизуйте УФ-сшиванием или запеканием, чтобы образец не потерялся во время окрашивания.
2. Необязательно, но часто используется: смочите мембрану в 5 процентах уксусной кислоты примерно на 15 минут.
3. Окрасьте в течение 5–10 минут в 0,02–0,04 процента метиленового синего в 0,3–0,5 M ацетате натрия около pH 5,2.
4. Промойте и обесцветьте в воде 5–15 минут, задокументируйте, затем удалите остаточный краситель перед гибридизацией.

Положительно заряженный нейлон доминирует в Northern-работе. Нитроцеллюлоза также работает с тем же протоколом уксусной кислоты и ацетата. Изображение используется для подтверждения переноса, сравнения полос 28S и 18S (или 23S и 16S для бактериальной РНК), маркировки лестниц и стандартов, а также ведения приблизительной записи нормализации общей РНК. Опубликованные методы Northern количественно оценивают окрашенные рибосомальные полосы для проверки загрузки, включая работу в области молочной науки, где использовались рибосомальные полосы метиленового синего для нормализации. Southern-мембраны можно визуализировать таким же способом, но краситель гораздо более распространен как проверка загрузки и переноса в Northern-анализе, а Southern-ДНК денатурируется перед переносом, поэтому показатели чувствительности геля не переносятся напрямую.

Пределы обнаружения и фон: где синий проигрывает

Сравнение ниже намеренно является приблизительным. Эффективность окрашивания зависит от процента геля, ширины полос, оптики и качества обесцвечивания. Рассматривайте каждое число как порядок величины, а не как спецификацию.

Контроль фона определяет, будет ли умеренный сигнал пригоден. Свободный краситель имеет интенсивный цвет, поэтому контраст достигается удалением несвязанного красителя без удаления связанного. Более концентрированное окрашивание редко повышает чувствительность. Оно в основном увеличивает время обесцвечивания. Проведите серию разведений на конкретном геле, мембране и камере и используйте только диапазон, где интегральная плотность остается пропорциональной входному количеству. Метиленовый синий поддерживает полуколичественную нормализацию загрузки. Это не количественный анализ с широким динамическим диапазоном, поскольку емкость мембраны, эффективность переноса, насыщение и обесцвечивание различаются между дорожками.

Ограничения совместимости: что сохраняется после окрашивания

Клонирование после окрашивания синим продемонстрировано. Флорес и коллеги вырезали окрашенные полосы агарозного геля, извлекали ДНК и лигировали и трансформировали ее, сообщая о лучшем клонировании по сравнению с этиленбромидом и УФ. Вероятная причина — меньшее фотоповреждение, а не преимущество самого красителя. Сокращайте воздействие белого света и пропускайте выделенную ДНК через обычную очистку из геля.

Для ПЦР и секвенирования доказательств меньше. Остаточный краситель связывается с нуклеиновыми кислотами, поэтому перед ферментативными этапами проводите обесцвечивание и очистку. Ожидается, что правильно очищенная ДНК из синего геля будет работать, но переносимость остатков между различными полимеразами и химиями секвенирования изучена недостаточно.