Метиленовый синий как анаэробный и кислородный индикатор: что доказывает изменение цвета

Техник герметизирует анаэробную банку, проверяет индикаторную полоску с метиленовым синим через крышку и видит то, что ожидает увидеть. Полоска изменила цвет с синего на белый. Он регистрирует запуск как анаэробный и переходит дальше. Два дня спустя одна чашка не показывает роста, а запаянная пробирка с бульоном внутри той же банки демонстрирует признаки воздействия кислорода. Полоска говорила правду. Ей задали неправильный вопрос.

Проблема заключается в смешении понятий. Анаэробный индикатор с метиленовым синим — это концепция окислительно-восстановительных реакций, а не концепция стерильности и не концепция валидации всей системы. Когда это различие становится ясным, полоска превращается в точный и честный инструмент с узкой задачей.

Концепция: обратимая окислительно-восстановительная пара

Растворённый метиленовый синий существует в двух состояниях. Окисленная форма — это знакомый синий катион. Восстановленная форма, называемая лейкометиленовым синим, бесцветна. При близком к нейтральному pH упрощённая полуреакция представляет собой превращение одного синего катиона плюс одного протона плюс двух электронов в одну бесцветную лейко-молекулу. Формальный потенциал находится около плюс 11 милливольт относительно стандартного водородного электрода при pH 7, что помещает его в диапазон, достижимый многими восстанавливающими системами и обратимый под действием кислорода.

Для восстановления требуется низкий локальный окислительно-восстановительный потенциал. Одного удаления кислорода недостаточно во всех случаях. Ранние исследования анаэробиоза показали, что метиленовый синий в обычной воде без кислорода сохранял цвет, если не присутствовало восстанавливающее вещество, а смеси декстрозного бульона примерно с 0,01 процентом красителя легко обесцвечивались при 37 C, тогда как такая же смесь при 4 C оставалась синей в течение суток, как сообщалось в экспериментах со свежей тканью и условиями анаэробного культивирования. Температура, pH, глюкоза, аскорбат, тиогликолят и восстанавливающая активность микроорганизмов определяют, доступны ли электроны.

Для повторного окисления нужен только кислород. Когда воздух достигает лейкоформы, она снова превращается в синюю форму. Современные инженерные индикаторы используют именно этот цикл: краситель плюс восстановитель плюс стабилизирующая матрица, бесцветные при низком содержании кислорода и снова синие при воздействии воздуха, как показано в гибридном кислородном индикаторе с метиленовым синим на основе красителя, восстановителя, поверхностно-активного вещества и глины. В этом прототипе использовались 0,01 миллимолярный краситель с 2,0 миллимолярным аскорбатом или глюкозой при pH 11; он становился бесцветным около 0,5 объёмного процента кислорода и различал менее 0,1 процента и более 0,5 процента кислорода в своей тестовой камере.

Таким образом, рабочий принцип прост. Синий цвет означает, что зона индикатора находится в окисленном состоянии. Бесцветный цвет означает, что зона индикатора достигла восстанавливающих условий с низким содержанием кислорода. Изменение является обратимым, локальным и химическим. Само по себе оно ничего не говорит о микроорганизмах.

Как работает индикаторная полоска с метиленовым синим в анаэробной банке

Индикаторная полоска с метиленовым синим для анаэробной банки представляет собой небольшую реакционную зону, размещённую в атмосфере банки, где её можно видеть без открытия сосуда. Коммерческие форматы различаются: бумажные полоски, таблетки, растворяемые или увлажняемые при подготовке, и новые гибридные бумаги. Для активации реакционной зоны некоторым требуется одна капля дистиллированной воды. Другие представляют собой сухие устройства, которые должны оставаться сухими. Инструкция к конкретному продукту является определяющей, поскольку увлажнение, расположение и время считывания являются частью химического процесса.

На практике результат считывается бинарно. Синий цвет означает, что кислород или недостаточно восстанавливающие условия сохраняются у полоски. Белый или бесцветный цвет означает, что у полоски установлены анаэробные окислительно-восстановительные условия. Некоторые коммерческие бумаги содержат красный фоновый пигмент, поэтому их восстановленный конечный цвет выглядит розовым, а не белым. Перед оценкой необходимо знать, какой конечный результат обещает ваш продукт.

Время зависит от системы. В одной установке типа GasPak изменение цвета начиналось примерно через час и завершалось в течение нескольких часов, тогда как контролируемое сравнение при комнатной температуре требовало более шести часов для метиленового синего. Окислительно-восстановительный потенциал среды в этой работе достигал примерно минус 100 милливольт через 60–100 минут, задолго до завершения изменения цвета красителя, и находился значительно ниже минус 200 милливольт к моменту полного обесцвечивания полоски. Индикатор отстаёт от атмосферы. Синяя полоска через один час не доказывает нарушение условий, а бесцветная полоска через шесть часов описывает состояние полоски через шесть часов.

Расположение имеет значение по той же причине. Держите полоску в газовой фазе, видимой через крышку, вдали от поверхности агара и питательных сред. Она сообщает о непосредственном окружении. Если положить её вплотную к холодной стенке, спрятать под чашками или позволить конденсату пропитать её, она будет показывать это микросреду, а не состояние банки.

Что показывает полоска и чего она не показывает

Рассматривайте индикатор с метиленовым синим для анаэробной банки как один сенсор в одном месте. Он устанавливает локальные окислительно-восстановительные и кислородные условия в собственной реакционной зоне, которые в целом могут представлять газовую фазу при достаточном перемешивании и выравнивании условий. Всё остальное является выводом, а вывод требует отдельного подтверждения.

Бесцветная полоска не подтверждает стерильность. Стерильность означает отсутствие жизнеспособных организмов и подтверждается валидированными процедурами стерилизации и контролями валидации культивирования. Банка может быть полностью анаэробной и при этом загрязнённой, или полностью стерильной и при этом аэробной.

Она не подтверждает состояние каждой части системы культивирования. Растворённый кислород внутри герметичной пробирки, кислород, захваченный глубоко в агаре, градиенты в заполненной банке и утечка, возникшая после считывания, выходят за пределы показаний одной полоски. Пространственные исследования показали наличие соседних синих и бесцветных зон в одном сосуде, где проникновение кислорода и восстанавливающая активность различались. Одна точка не может сертифицировать весь объём.

Она не доказывает непрерывную анаэробность. Однократное считывание полоски при установке ничего не говорит о двадцатом часе. Современные работы по контролю качества анаэробных условий предупреждают, что химические индикаторы описывают атмосферу в момент считывания и могут выглядеть удовлетворительно даже при низком остаточном содержании кислорода. Непрерывная документация или контрольные точки, а не один финальный взгляд, связывают показания полоски с инкубацией.

О сопутствующей химии изменения цвета см. как метиленовый синий циклически переходит между окисленным и восстановленным состояниями. О более широком влиянии кислорода на работу с образцами см. контроль кислорода в микроскопии и культуральных исследованиях.

Схема, которую стоит держать рядом с банкой

На рисунке ниже статья сжата до одной справочной схемы для рабочего места. Три состояния одной и той же полоски, два направления реакции и граница между данными индикатора и валидацией системы.

Режимы отказа, из-за которых полоска остаётся синей или создаёт ложное чувство уверенности

Большинство отказов относится к пяти группам. Каждая имеет характерный признак.

Протекающая банка или пакет продолжает подавать кислород в реакционную зону. Полоска остаётся синей или снова становится синей после обесцвечивания. Проверьте крышку, прокладку, зажимы и поверхности уплотнения, прежде чем винить химию.

Израсходованный или неправильно активированный генератор газа не удаляет кислород. В старых системах с активацией водой отсутствие конденсата примерно через 10–15 минут и отсутствие нагрева крышки примерно через 20–40 минут были ранними предупреждениями для этой системы. Недостаточный размер саше в перегруженной банке вызывает такую же проблему.

Отравление катализатора относится только к старым системам водород плюс палладий, где палладий соединяет водород и кислород с образованием воды. Влага и сероводород разрушают его. Многие современные саше вообще не используют палладий, поэтому не применяйте это исправление там, где оно неприменимо.

Повреждённая или неправильно хранившаяся полоска выходит из строя незаметно. Краситель и восстановитель теряют обратимость при хранении, что является одной из причин разработки гибридных формул, устойчивых к выцветанию на свету и потере свойств при хранении. Отбраковывайте просроченные запасы, упаковки с ненормальным исходным цветом и полоски, увлажнённые там, где они должны быть сухими, или оставленные сухими там, где требуется увлажнение.

Градиент или задержка реакции вводят читателя в заблуждение, а не химию. Плохо перемешанная газовая фаза, герметичные пробирки с растворённым кислородом и полутвёрдые среды сохраняют собственные условия дольше, чем предполагает полоска. Полоски с резазурином проходят через розовый цвет к бесцветному и часто рекламируются как более быстрые, но их пороговые значения относятся к собственной формуле и не переносятся на метиленовый синий.

Контроли и протокол считывания, который стоит копировать

Два недорогих контроля позволяют выявить большинство неправильных интерпретаций. Держите свежую контрольную полоску на воздухе рядом с запуском. Рабочая полоска с метиленовым синим остаётся синей в таких условиях. Некоторые упакованные индикаторы изначально бледные и становятся синими при открытии, что само по себе является функциональной проверкой. Также периодически помещайте свежую полоску в ранее валидированную анаэробную систему. Она должна достичь подтверждённого восстановленного конечного состояния за время, указанное производителем. Если любой из контролей работает неправильно, замените партию перед тем, как доверять показаниям банки.

Протокол считывания следует из механизма. Разместите полоску так, чтобы газовую фазу можно было видеть без открытия банки, соблюдая инструкции продукта относительно контакта со стенкой и увлажнения. Запишите исходный цвет, время герметизации банки и цвет в контрольную точку, указанную производителем. Если конструкция сосуда позволяет, фиксируйте, что индикатор оставался восстановленным в определённых контрольных точках во время инкубации. Запишите конечный цвет непосредственно перед открытием. Этот цвет до открытия является конечным результатом для данного запуска. После открытия ожидайте повторное посинение и не позволяйте ему переписывать историю.

Если полоска остаётся синей дольше указанного времени, считайте анаэробность неподтверждённой. Проверяйте цепочку по порядку: герметичность, саше, катализатор при наличии, увлажнение и срок годности индикатора, затем работу индикатора с воздушным контролем. Только после подтверждения атмосферы можно интерпретировать рост или отсутствие роста, используя анаэробную постановку культуры и контроли организмов, соответствующие применению.

Полоска заслуживает последнего слова в своей собственной области. Синяя или бесцветная, она отвечает только на один вопрос в одном месте в одно время. Задайте ей этот вопрос по расписанию и с контролями рядом — и она даст надёжный ответ. Спросите её о стерильности, о каждой пробирке или обо всей инкубации по одному взгляду — и никакая индикаторная химия не сможет исправить такую интерпретацию.