Метиленовый синий и воздействие света: длина волны, облучённость и геометрия воздействия

Две статьи сообщают о воздействии на метиленовый синий 10 Дж на квадратный см света. В одной бактерии погибают. В другой не наблюдается ничего измеримого. Читатель, сравнивающий только дозу, делает вывод, что область исследований противоречива. Область исследований последовательна. Доза никогда не была всем воздействием.

Воздействие света — это небольшая система параметров, которые действуют совместно: длина волны, облучённость, длительность, результирующий флюенс, доступность кислорода, концентрация красителя и состояние агрегации, время между нанесением красителя и светом, а также оптический путь, который свет фактически проходит через образец. Измените один параметр — и фотохимия изменится. Эта статья рассматривает каждый параметр, а затем различает ближнюю инфракрасную фотобиомодуляцию и прямую фотоактивацию красителя, поскольку эти два режима чаще всего путают.

Длина волны определяет, участвует ли краситель

Метиленовый синий в воде сильно поглощает красный свет в форме мономера, с пиком около 664–665 нм и плечом на более короткой длине волны около 610 нм, которое увеличивается по мере агрегации красителя в димеры и более крупные структуры. Молярный коэффициент экстинкции около пика находится в диапазоне 65 000–85 000 M-1 cm-1, поэтому микромолярные растворы уже имеют интенсивный синий цвет. Ранний фотохимический обзор метиленового синего с ДНК и биологическими субстратами описывает это поведение поглощения и последующую химию возбуждённого состояния: поглощение переводит молекулу в короткоживущее синглетное состояние, затем происходит переход в более долгоживущее триплетное состояние с указанными выходами около 0,5, которое в аэрированном растворе гасится кислородом примерно за 2 микросекунды.

Именно на этом этапе гашения два фотохимических пути расходятся. В химии типа II триплетный краситель передаёт энергию основному состоянию кислорода и образует синглетный кислород, с обычно приводимыми выходами около 0,52. В химии типа I триплет передаёт электрон или водород субстрату, создавая радикалы, включая супероксид и гидроксильные частицы. Оба процесса могут происходить одновременно, и обычный фотодинамический эффект остаётся сильно зависимым от кислорода даже при вкладе типа I.

Следствие для выбора длины волны метиленового синего — простое правило. Красный свет примерно от 630 до 680 нм перекрывается с полосой красителя, а 660–665 нм находится около максимума мономера, поэтому он может запускать химию фотосенсибилизатора там, где присутствует значительное количество красителя. Ближний инфракрасный свет при 810 нм находится далеко за пределами полосы поглощения основного состояния, поэтому он плохо подходит для прямого возбуждения красителя. Концентрация усложняет картину одним важным образом: при повышении концентрации больше красителя находится в димерных и агрегированных формах, которые поглощают ближе к 610 нм и менее эффективно фотосенсибилизируют на одну молекулу, поэтому удвоение количества красителя не удваивает эффект. Связанный обзор метиленового синего с терапией красным светом рассматривает это правило поглощения как предварительное условие любой фотосенсибилизированной реакции.

Облучённость, длительность и флюенс — это три параметра, а не один

Флюенс в Дж на квадратный см — это облучённость, умноженная на время. Указание только флюенса скрывает скорость, с которой поступает энергия, а скорость имеет значение.

Высокая облучённость, поданная за короткое время, и низкая облучённость, поданная за длительное время, могут дать одинаковый флюенс при различной химии. Высокая облучённость быстрее расходует растворённый кислород, чем его заменяет диффузия, что ограничивает кислородозависимый путь типа II в течение части воздействия. Она также выделяет тепло, а ткань реагирует на нагрев изменениями кровотока, которые меняют как оксигенацию, так и распределение красителя. Низкая облучённость при длительном воздействии поддерживает поступление кислорода, но даёт процессам восстановления и реоксигенации время действовать во время самого воздействия. В учебниках по фотохимии предположение о том, что имеет значение только общая доза, называют законом взаимозаменяемости. Оно не работает, когда участвуют кислород, нагрев или биология, а в тканях это происходит почти всегда.

Антимикробные фотодинамические воздействия с метиленовым синим у людей обычно используют 6–18 Дж на квадратный см, что пересекается со значениями фотобиомодуляции. Поэтому одного флюенса недостаточно для определения режима. Воздействие 10 Дж на квадратный см при 660 нм на ткань, содержащую краситель, представляет собой фотохимию, управляемую фотосенсибилизатором. То же воздействие при 810 нм на ткань со следовыми количествами красителя — это совершенно другое. Число совпадает. Концепция отличается.

Оптический путь и геометрия образца определяют, с чем встречается свет

Поведение по закону Бера–Ламберта означает, что передняя часть образца получает значительно больше света, чем задняя. В кювете с десятками микромолей красителя первый миллиметр может поглотить большую часть падающего красного света, оставляя более глубокие слои практически без воздействия. Уменьшите тот же раствор до мелкой лунки с небольшим объёмом — и воздействие становится почти равномерным. Тот же краситель, та же лампа, тот же флюенс на поверхности, другой результат.

Ткани добавляют рассеяние поверх поглощения. Красный свет около 660 нм проникает на порядок миллиметров, а точная глубина зависит от содержания крови, пигментации и типа ткани. Лунки создают собственные артефакты: линзирование мениска, отражение от стенок, затенение крайних лунок и нагрев небольших объёмов под источником. Две лаборатории, сообщающие одинаковые настройки лампы, но использующие разные типы планшетов, объёмы или расстояния до источника, проводят разные эксперименты.

Расстояние требует отдельного внимания, поскольку это наиболее распространённая скрытая переменная. Облучённость быстро падает с расстоянием от некогерентного источника, поэтому лампа, перемещённая с 2 см до 5 см над планшетом, может снизить облучённость в несколько раз, хотя в разделе методов всё ещё указаны те же параметры. Без измеренной облучённости на поверхности образца опубликованные флюенсы, рассчитанные по номинальной мощности производителя, являются оценками, а не измерениями.

Аннотированное руководство по параметрам: что делает воздействие воспроизводимым

Исходный материал для этой страницы — контрольный список. Любое исследование светового воздействия, в котором отсутствуют эти пункты, нельзя сравнивать с другим, каким бы похожим ни выглядела заявленная доза.

1. Длина волны и ширина полосы. Пиковое значение и полная ширина, а не название цвета. Красный LED охватывает диапазон 630–680 нм с сильно различным поглощением красителя.
2. Облучённость на поверхности образца, измеренная в мВт на квадратный см. Мощность производителя не является облучённостью.
3. Длительность и импульсный режим. Непрерывная или импульсная подача, включая частоту импульсов и рабочий цикл, где применимо.
4. Флюенс, рассчитанный из измеренной пары параметров выше, в Дж на квадратный см.
5. Концентрация красителя, состав и состояние агрегации. Мономер около 664 нм фотосенсибилизирует иначе, чем агрегаты около 610 нм.
6. Интервал между введением красителя и светом. Минуты или часы между введением красителя и облучением, определяющие, где находится краситель в момент воздействия света.
7. Оксигенация. Аэрированный раствор против гипоксической ткани напрямую меняет баланс типа I и типа II.
8. Геометрия. Глубина образца, объём, тип сосуда, расстояние и угол источника, а также глубина мишени в ткани.

Полезная привычка при чтении исследований: сначала проверяйте интервал между введением красителя и светом. Он показывает назначение эксперимента. Фотодинамические конструкции намеренно облучают ткань, содержащую краситель. Комбинированные конструкции могут разделять эти два воздействия специально, как описано ниже.

Ближняя инфракрасная фотобиомодуляция не является фотоактивацией красителя

Фотобиомодуляция, обычно сокращённо PBM, использует красный или ближний инфракрасный свет для изменения эндогенных сигналов без добавления фотосенсибилизатора. Фотодинамическая терапия, обычно сокращённо PDT, использует три компонента вместе: свет, который поглощает сенсибилизатор, сам сенсибилизатор и кислород для создания всплеска активных частиц, повреждающих цель. Обзор митохондрий как мишени нейропротекции объединяет метиленовый синий с PBM, поскольку они воздействуют на дыхание с разных направлений: краситель действует как каталитический редокс-цикл, поддерживающий поток электронов, тогда как предполагается, что PBM способствует отделению ингибирующего оксида азота от цитохром c оксидазы в комплексе IV. Этот механизм фермента следует обозначать как гипотезу.

Два наиболее часто цитируемых комбинированных исследования на мышах используют свет 810 нм, именно поэтому они не демонстрируют фотоактивацию красителя. В исследовании предварительного воздействия перед лишением сна мыши получали ежедневный метиленовый синий в дозе 0,5 мг на кг, импульсный лазер 810 нм через день или оба воздействия перед лишением сна. Комбинированное предварительное воздействие сохраняло показатели памяти и синаптические белки гиппокампа, тогда как отдельные воздействия в основном не давали такого результата. В исследовании хронического стресса с одновременным лечением мыши получали PBM 810 нм при 8 Дж на квадратный см вместе с ежедневным красителем 0,5 мг на кг, причём лазер применяли сначала, а краситель вводили через два часа специально, чтобы избежать облучения ткани, содержащей краситель. Все три группы демонстрировали улучшение показателей обучения, при этом дополнительный эффект в основном наблюдался для сывороточного кортизола и активных форм кислорода мозга. Эти результаты проверяют совместное использование двух митохондриальных воздействий — различие, которое коллекция фотодинамических исследований сохраняет, фиксируя длину волны для каждого применения.

Данные по коже находятся с другой стороны. Исследования метиленового синего плюс свет на коже человека сосредоточены в диапазоне 630–680 нм с местным или внутрикожным красителем и разрушительным или ремоделирующим намерением, что по определению является PDT. Использование таких данных как доказательства того, что краситель усиливает PBM, или использование спасения мышей при 810 нм как доказательства того, что панель 660 нм плюс краситель является когнитивным протоколом, смешивает разные режимы. Справочник по дозированию и фармакологии и руководство по безопасности и взаимодействиям дополнительно рассматривают части этой темы, связанные с концентрацией и противопоказаниями.

Называйте концепцию до сравнения чисел. Длина волны определяет, поглощает ли краситель свет. Облучённость и длительность определяют, что химия делает с этим поглощением. Геометрия определяет, какая часть образца испытывает воздействие. Два воздействия, совпадающие по одному параметру и различающиеся по остальным, являются разными экспериментами, и именно ошибка их взаимозаменяемого рассмотрения является причиной существования этого руководства. Из этого не следует никакого домашнего протокола; свет с подходящей длиной волны в сочетании с системным красителем превращает иначе модулирующее воздействие в фотохимию, управляемую фотосенсибилизатором, что относится к области клинического применения.