Измерение митохондриальных эффектов метиленового синего: кислород, АТФ и мембранный потенциал

Представим, что лаборатория добавляет метиленовый синий к митохондриям с нарушенным дыханием и наблюдает рост потребления кислорода. Естественное утверждение — что краситель восстановил функцию митохондрий. Это утверждение может быть неверным. Поток кислорода, синтез АТФ и мембранный потенциал — три разных понятия. Они связаны одной органеллой так же, как резервное копирование, синхронизация и общий доступ связаны одной облачной папкой: они взаимосвязаны, но регулируются разными правилами. Если перепутать одно с другим, интерпретация становится неверной, даже когда каждое измерение технически выполнено правильно.

Метиленовый синий повышает вероятность такой ошибки, потому что он участвует в системе, которую измеряет. Это редокс-циклер, который принимает электроны выше по цепи и передает их ниже по цепи, липофильный катион, который накапливается в энергетически активных митохондриях, и интенсивно синий компонент, который поглощает и излучает свет в тех же диапазонах, что и распространенные зонды. Один показатель не может одновременно отражать все эти процессы. Надежный подход, показанный в исследованиях митохондрий из Будапешта, заключается в измерении потока кислорода плюс скорости синтеза АТФ плюс мембранного потенциала плюс высвобождения перекиси водорода с контролями, специфичными для красителя, на каждом этапе.

Ресpiрометрия измеряет поток кислорода, а не выход энергии

Ресpiрометрия высокого разрешения, будь то с помощью Oroboros Oxygraph или анализатора внеклеточного потока Seahorse, показывает только одно: насколько быстро восстанавливается кислород. Она не показывает, сколько протонов было перекачано на электрон, насколько сохранялся градиент или использовала ли его АТФ-синтаза.

Терминология имеет значение. В изолированных митохондриях субстрат без АДФ дает дыхание утечки, субстрат с насыщенной концентрацией АДФ дает способность окислительного фосфорилирования, а титрование разобщителем дает максимальную способность переноса электронов. В интактных клетках эквивалентами Seahorse являются базальное дыхание, чувствительное к олигомицину АТФ-связанное дыхание, утечка протонов, максимальное дыхание, определяемое FCCP, и устойчивое к ротенону плюс антимицинину немитохондриальное потребление кислорода. Называть показатели Seahorse состояниями State 3 и State 4 означает приписывать точность, которую данный препарат не обеспечивает, как ясно показывает платформа Agilent Mito Stress Test.

Метиленовый синий нарушает интуитивную связь между увеличением кислорода и увеличением энергии. В изолированных митохондриях мозга морских свинок концентрация красителя от 100 нМ до 1 мкМ увеличивала базовое потребление кислорода с субстратами глутамат плюс малат, сукцинат и альфа-глицерофосфат, причем примерно на 64 процента при использовании альфа-глицерофосфата, однако стимулированное АДФ дыхание в здоровых митохондриях практически не изменялось, согласно исследованию изолированных митохондрий мозга. Поскольку утечка увеличилась, а поток при стимуляции АДФ остался неизменным, рассчитанное соотношение контроля дыхания снижается. Это снижение не означает, что краситель повредил митохондрии. Оно означает, что краситель добавил кислород-потребляющий редокс-цикл поверх нормального дыхания. Анализ потребления кислорода метиленовым синим, который сообщает только о росте, измерил реальную химию и ничего не сказал о сохранении энергии.

Эксперименты по восстановлению показывают тот же разрыв в более крупном масштабе. При блокировке комплекса I поток кислорода восстановился примерно втрое, тогда как синтез АТФ восстановился только примерно в 1,5 раза. Больше кислорода достигло электрода. Меньшая его часть была использована для производства АТФ. Любое утверждение об улучшении окислительного фосфорилирования требует оценки стороны АТФ, желательно выраженной как отношение АТФ к кислороду с указанным способом расчета знаменателя.

Анализы АТФ измеряют скорость синтеза, которую нельзя заменить содержанием

Анализ АТФ отвечает на другой вопрос: сколько АТФ генерируется за единицу времени. Кинетическое измерение, либо люминесценция люциферазы светлячка, отслеживаемая в течение минут, либо связанный анализ с гексокиназой и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой при измерении на 340 нм, дает скорость. Однократное конечное измерение общего содержания АТФ показывает содержание, которое отражает разницу между синтезом и потреблением и само по себе мало говорит об окислительном фосфорилировании.

Группа из Будапешта использовала связанный ферментативный метод с подавлением аденилаткиназы и обнаружила, что метиленовый синий в концентрации 1–2 мкМ умеренно, но статистически значимо увеличивал производство АТФ в митохондриях, обработанных ротеноном и антимицином. Это настоящее восстановление, но оно частичное. Исследование токсичности TEGDMA дало аналогичную картину в другой модели: стоматологический мономер TEGDMA в концентрации 5 мМ снижал дыхание, связанное с комплексом I, примерно с 286 до 28 единиц потока, а 2 мкМ красителя восстанавливали его примерно до 86.

Для окрашенного редокс-соединения обязательны два контроля. Во-первых, используйте олигомицин, чтобы определить, какая часть измеряемого синтеза АТФ зависит от АТФ-синтазы. Во-вторых, выполните контроль восстановления добавлением известной АТФ в бесклеточную систему с полным набором реагентов и точными концентрациями красителя, используемыми в эксперименте, как минимум 0, 100 нМ, 300 нМ, 1 мкМ и 2 мкМ. Краситель может поглощать испускаемый свет, ингибировать фермент-репортер или изменять редокс-химию реагентов, и общие рекомендации по анализам люциферазы рекомендуют биохимические контрскрининги именно для такого класса помех. Не следует считать, что 1 мкМ не вызывает артефактов, поскольку тушение обычно усиливается при более высоких концентрациях.

Зонды мембранного потенциала измеряют распределение красителя, а не поток

Сафранин O, TMRM и TMRE, родамин 123 и JC-1 — все являются проникающими через мембрану катионами. Они накапливаются в отрицательно заряженном матриксе в соответствии с электрохимическим равновесием, поэтому общая флуоресценция косвенно отражает потенциал через расположение зонда. Ни один из них не измеряет АТФ или поток электронов.

Каждый зонд имеет предпочтительный способ применения. Сафранин O подходит для изолированных митохондрий и пермеабилизированных клеток, обычно около 2 мкМ с возбуждением около 495 нм и эмиссией около 585 нм, работая в режиме тушения, где изменение поглощения изменяет общую флуоресценцию. TMRM и TMRE подходят для интактных клеток при низкой наномолярной загрузке в режиме без тушения, где деполяризация высвобождает краситель и митохондриальная флуоресценция снижается; при высокой загрузке направление сигнала может измениться из-за самотушения. JC-1 дает удобное соотношение зеленого к красному, но зависит от загрузки и массы митохондрий, что делает его менее подходящим для количественной работы по сравнению с тщательно контролируемым TMRM. Эти компромиссы описаны в широко используемом обзоре зондов мембранного потенциала митохондрий.

Метиленовый синий оптически взаимодействует именно в рабочих концентрациях. Его полосы поглощения около 600–665 нм перекрываются с эмиссией красных зондов, поэтому внутренние фильтрующие эффекты, тушение и поглощение возбуждающего света являются возможными источниками помех. Краситель также является вторым липофильным катионом, собственное распределение которого изменяется вместе с измеряемым потенциалом. Защита от ошибок — это избыточность плюс холостые образцы: только зонд, только краситель, зонд плюс каждая концентрация красителя, полная деполяризация с FCCP как нулевой точкой отсчета и, желательно, второй оптически отличающийся зонд. Исследование обхода комплекса III создало такой прецедент, повторив восстановление мембранного потенциала с использованием как сафранина O, так и TMRM после ингибирования антимицином и миксотиазолом и получив одинаковое качественное восстановление. Один оптический показатель — это намек. Два независимых показателя — это доказательство.

Три препарата, три разных вопроса

Изолированные митохондрии, пермеабилизированные клетки и интактные клетки — это не взаимозаменяемые уровни чувствительности одного анализа. Это разные концепции с разными операционными принципами.

Изолированные митохондрии сохраняют дыхательную цепь, внутреннюю мембрану и аппарат матрикса, удаляя плазматическую мембрану, цитозоль и архитектуру сети. Это удаление является целью: субстраты, АДФ, ингибиторы и концентрации красителя точно определены, поэтому можно назначить конкретный путь. Цена — потеря естественного снабжения субстратами, сигнализации и потребности.

Пермеабилизированные клетки сохраняют митохондрии внутри большей части клеточной архитектуры, позволяя внешним субстратам и АДФ проходить через открытую плазматическую мембрану. Это правильный инструмент для определения дефекта пути внутри клеточного контекста. Чрезмерная пермеабилизация повреждает наружную мембрану, а регуляция цитозоля вымывается.

Интактные клетки сохраняют все: барьер плазматической мембраны, цитозольные восстановители, транспорт эндогенных субстратов, митохондриальную сеть и потребность в АТФ. Они наиболее близки к физиологии и дальше всего от механизма, поскольку поглощение, восстановление и секвестрация красителя формируют фактическую митохондриальную экспозицию.

Исследование TEGDMA намеренно использовало все три уровня: изолированные митохондрии мозга для восстановления окисления и потенциала красителем, пермеабилизированные стволовые клетки зубной пульпы главным образом для локализации поражения на окисление субстратов, связанное с комплексом I, и интактные стволовые клетки для оценки физиологического суммарного эффекта 2 мкМ красителя на подавленное потребление кислорода. Для читателей, сравнивающих митохондриальные показатели в разных препаратах, сопутствующее объяснение о том, как метиленовый синий перемещает электроны через дыхательную цепь, дает базовый путь, а руководство по чтению исследований дыхания с метиленовым синим описывает логику доз и ингибиторов.

Контроли, необходимые для редокс-активного красителя

Редокс-циклер требует более длинного списка контролей, чем обычный ингибитор, поскольку химия только красителя может имитировать биологические эффекты.

Для ресpiрометрии выполните измерение пустой камеры с буфером для оценки дрейфа, буфера плюс красителя без биологического материала, красителя плюс любого внеклеточного восстановителя, присутствующего в анализе, и конечный ротенон плюс антимицин для определения немитохондриального потребления кислорода в интактных клетках. Учтите, что восстановленный краситель повторно окисляется путем передачи электронов кислороду с образованием перекиси водорода, поэтому контроль только с красителем без донора электронов недооценивает бесклеточный источник потребления кислорода, который появляется при наличии NADH или NADPH.

Для перекиси водорода предпочтительнее использовать калиброванный Amplex UltraRed плюс пероксидазу хрена вместо неспецифических красителей DCFDA, проверять результат с помощью каталазы и тестировать зависимость от освещения, поскольку краситель является фотосенсибилизатором. Исследование митохондрий мозга показало, что нагрузка перекисью возрастала более чем в четыре раза уже при 100 нМ красителя, а удаление замедлялось, причем перекись образовывалась напрямую восстановленным красителем без промежуточного супероксида. Подробности выбора зонда и контроля света относятся к сопутствующему материалу о измерении активных форм кислорода в экспериментах с красителями, а более широкий вопрос о том, когда перекись является сигналом, а когда нагрузкой, рассматривается вместе с клеточным редокс-балансом и заявлениями об антиоксидантных свойствах.

Для утверждений о пути проверьте оба участка ингибирования комплекса III: антимицин A на участке Qi и миксотиазол на участке Qo, а также конечную точку комплекса IV с цианидом. Более раннее исследование мозга мышей сообщало о восстановлении дыхания красителем при блокировке ротеноном, но не антимицином, тогда как более позднее исследование трех видов обнаружило частичное восстановление с обоими ингибиторами и признаки прямого восстановления цитохрома c. Рассматривайте обходной путь как совместимый с новыми данными, а не как окончательно установленный, поскольку концентрация красителя, участок ингибирования, состояние субстрата и распределение красителя изменяют наблюдаемый маршрут.

Матрица выбора анализа

Используйте эту таблицу, чтобы выбирать измерение исходя из вопроса, а не наоборот.