Эксперименты, связавшие метиленовый синий с клеточным дыханием

Дефибринированная человеческая кровь, нагретая до 37 °C в течение трёх часов, потребляет около двух процентов содержащегося в ней кислорода. Добавьте небольшое количество метиленового синего перед инкубацией — и та же кровь потребляет около шестидесяти пяти процентов. Ничего в клетках не изменилось. Изменился только раствор.

Это число взято из статьи 1928 года Джорджа Харропа и Э. С. Гусмана Баррона из Университета Джонса Хопкинса и является источником часто повторяемого утверждения, что метиленовый синий улучшает клеточное дыхание. Это утверждение не является ложным, но оно уже, чем кажется.

Что на самом деле измеряет число в таблице

Конечной точкой было потребление кислорода, определённое методом газового анализа. Харроп и Баррон фильтровали свежевзятую кровь через хлопковую вату при 10 °C, чтобы удалить белые клетки, насыщали образец кислородом, разделяли его на две части, добавляли краситель в одну из них и анализировали обе после инкубации. Количество лейкоцитов редко превышало около тысячи на кубический миллиметр. Потребление кислорода выражали как долю первоначального содержания кислорода в образце, которая исчезла.

Они также измеряли углекислый газ, и здесь метод создавал проблему. Дефибринированная кровь выделяла до двух миллимолей углекислого газа на 100 мл в течение первого часа инкубации по причинам, не связанным с изучаемой реакцией, поэтому дыхательные коэффициенты для цельной крови были непригодны. Только промытые клетки в растворе Локка давали интерпретируемые значения, и они находились в диапазоне от 0,73 до 0,80 как с красителем, так и без него.

Эта деталь не является мелочью. "Дыхание" в этих работах означает газообмен в закрытом сосуде. Разница между потреблением кислорода и полезным выходом энергии отдельно рассматривается в том, что потребление кислорода говорит и не говорит об АТФ.

Краситель сильнее всего действовал там, где клетки дышали меньше всего

Зрелые эритроциты млекопитающих имеют практически неизмеримое потребление кислорода. Ядерные эритроциты птиц имеют такое потребление. Харроп и Баррон исследовали оба типа, и этот контраст является основой их аргумента.

В образцах млекопитающих краситель увеличивал показатели в двадцать–пятьдесят раз. В крови гуся, клетки которой уже дышали, он никогда не увеличивал скорость более чем вдвое. Чем выше было исходное дыхание, тем меньше мог добавить краситель.

Та же закономерность наблюдается внутри одного вида. Образец крови человека с истинной полицитемией, содержащий незрелые клетки, потреблял 11,3 процента кислорода без красителя против 2,8 процента для промытых клеток здорового донора. Краситель увеличивал показатель только до 63,4 процента — шестикратное ускорение, тогда как нормальные клетки ускорялись почти в тридцать раз. Краситель приближал поведение зрелых клеток к поведению незрелых, что и утверждали авторы.

Цианид должен был остановить этот процесс

Было известно, что цианид останавливает клеточное окисление. Харроп и Баррон всё равно добавили его вместе с красителем.

Результаты с кровью крупного рогатого скота являются показательными. Содержание кислорода снизилось с 22,61 до 22,03 объёмных процентов за три часа без добавок. С метиленовым синим оно снизилось до 12,84. С метиленовым синим и одной пяти тысячной молярного раствора цианида калия оно снизилось до 12,74. Эффект красителя практически не изменился.

Рисунок: непрерывная запись микрораспирации человеческих эритроцитов. Стрелка показывает добавление метиленового синего. До этого момента кривая почти плоская; после него она постепенно повышается. Воспроизведено из Harrop and Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Их вывод заключался в том, что краситель действует как переносчик кислорода, "поставляя вещество, исчезнувшее из взрослых незрелых эритроцитов млекопитающих без ядра". Два года спустя Майклис и Саломон из Института Рокфеллера сформулировали разногласие в его окончательной форме. Либо эффект красителя был "случайным свойством красителя", либо краситель был "моделью некоторого неизвестного вещества в организмах". Эта развилка не была полностью закрыта. Изменилось то, что теперь клетки можно описывать гораздо точнее.

Экстракт печени делал то же самое

Майклис и Саломон показали, что экстракты органов холодной водой вызывают такое же усиление. Самым сильным был экстракт печени крысы, за ним следовали почки, селезёнка и семенники. Мозг, мышцы и сыворотка крови практически не оказывали эффекта или не оказывали его вовсе.

Затем они проверили экстракт с угарным газом. Дыхание, вызванное либо экстрактом, либо красителем, не изменялось в смеси из 98 процентов угарного газа и 2 процентов кислорода. Та же газовая смесь подавляла дыхание дрожжей и ядерных эритроцитов птиц примерно на 60–80 процентов, что соответствовало описанию Варбурга фермента дыхания, чувствительного к угарному газу. Следовательно, неизвестное тканевое вещество не было ферментом Варбурга.

По пути отпало несколько возможных кандидатов. Восстановленный глутатион и цистеин вызывали только потребление кислорода, необходимое для их собственного окисления. Коэнзим Хардена и Янга был исключён, поскольку больше всего его содержится в мышцах, а они показали почти минимальный эффект. Цитохром Кейлина, названный несколькими годами ранее, столкнулся с тем же противоречием. Их собственное предположение о том, что активное вещество происходит из клеточного ядра, они назвали лишь предположением.

Эффект зависел от условий

Клетки должны были оставаться неповреждёнными. Гемолиз дистиллированной водой или многократное замораживание устраняли реакцию на краситель и экстракт, а частичный гемолиз уменьшал её пропорционально.

Также требовался сахар. Глюкоза, фруктоза и сахароза поддерживали вызванное красителем дыхание; маннитол — нет. Без сахара дыхания вообще не было, и казалось, что краситель повреждает клетки в процессе, поэтому добавление глюкозы через один или два часа уже не восстанавливало реакцию. Авторы предположили, что краситель окисляет структурный компонент, необходимый клетке.

Освещение значительно усиливало эффект красителя, хотя он был заметен и в темноте. Другие восстанавливаемые красители вели себя иначе: толуиленовый синий соответствовал или превосходил метиленовый синий, тогда как индигодисульфонат почти ничего не делал. Чёткой связи между окислительно-восстановительным потенциалом красителя и величиной эффекта не обнаружили, что авторы объясняли проницаемостью мембраны и токсичностью.

Эффект был связан с ферментацией, а не с дыханием

Исследование Баррона 1930 года перешло от клеточных суспензий к срезам тканей нормальных органов крыс и трансплантированных опухолей.

В тканях без аэробного гликолиза метиленовый синий не оказывал эффекта или немного подавлял потребление кислорода: почки примерно на 14 процентов, поджелудочная железа примерно на 14 процентов, печень примерно на 5 процентов. В тканях, которые ферментируют при наличии кислорода, он увеличивал потребление: селезёнка примерно на 8 процентов, мозг примерно на 13 процентов. Увеличение в опухолях составляло от примерно 27 процентов в человеческой карциноме молочной железы до более чем 80 процентов в саркоме Рауса у курицы, приблизительно пропорционально аэробному гликолизу каждой ткани.

Рисунок: каждая точка представляет один тип ткани. Горизонтальная ось — аэробный гликолиз; вертикальная ось — изменение потребления кислорода после добавления метиленового синего. Данные из Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Table 6, PMID 19869777.

Эксперимент с цианидом затем дал зеркальную картину. Когда дыхание в ранее не реагировавших тканях блокировали цианидом и проявлялась ферментация, краситель снова увеличивал потребление кислорода: почки примерно на 59 процентов, печень примерно на 19 процентов, селезёнка примерно на 286 процентов, семенники примерно на 200 процентов.

Баррон предположил, что краситель может служить тестом ферментативной способности клетки или ткани, и завершил работу предположением: поколения культур опухолей в среде с красителем однажды могут сделать метаболизм опухоли постоянно похожим на метаболизм нормальной ткани. Это был исследовательский вопрос, сформулированный в 1930 году. Это не утверждение о лечении.

Что эти эксперименты не могли измерять

В 1928 и 1930 годах "дыхание" означало потребление кислорода. Аденозинтрифосфат впервые был описан в 1929 году, а демонстрация того, что выделенные митохондрии этерифицируют фосфат при переносе электронов, появилась в 1949 году. Ни одна из ранних работ по метиленовому синему не могла измерять производство энергии, и ни одна из них этого не утверждала.

Клетки являются второй проблемой. Зрелые эритроциты млекопитающих не содержат митохондрий. На стадии ретикулоцитов они удаляют митохондрии и рибосомы посредством избирательной аутофагии, поэтому зрелая красная клетка работает за счёт гликолиза и использует пентозофосфатный путь главным образом для NADPH, а не для АТФ. В экспериментах 1928 года не было дыхательной цепи, которую можно было бы восстановить. То, что потребляло кислород, делало что-то другое.

Теперь это другое явление описано достаточно хорошо. Метиленовый синий принимает электроны от клеточных восстанавливающих эквивалентов и превращается в лейкометиленовый синий, который повторно окисляется молекулярным кислородом, замыкая цикл. В человеческих эритроцитах NADPH-зависимая флавинредуктаза и родственные дисульфидредуктазы выполняют этап восстановления. Исследование 1976 года с использованием меченой глюкозы показало, что краситель стимулирует пентозофосфатный путь, что эффект низких концентраций зависит от оксигемоглобина, а более высокая концентрация, 0,1 мМ, образует перекись водорода. Восстановленный краситель при взаимодействии с кислородом создаёт перекись, а не фосфатные связи.

В митохондриях картина более спорная, чем это представляют популярные обзоры. Одна линия исследований утверждает, что краситель принимает электроны в области комплекса I и передаёт их цитохрому c. Другая работа показала, что в митохондриях мозга мышей он не может восстановить дыхание после блока антимицином и указывает на место приёма электронов у участка связывания убихинола комплекса III. Третья работа показала, что низкие концентрации повышают исходное потребление кислорода, оставляя без изменений дыхание, стимулированное АДФ. Наиболее прямое выражение сути заключается в том, что вызванное метиленовым синим потребление кислорода вообще не зависит от окислительного фосфорилирования: оно сохранялось при ингибировании дыхательной цепи и в препаратах без неё.

Существуют также прямые измерения разницы между этими двумя величинами. В изолированных митохондриях печени крысы увеличение концентрации красителя снижало коэффициенты контроля дыхания и вызывало набухание, что авторы описали как разобщение окислительного фосфорилирования. В перфузируемой печени крысы метиленовый синий увеличивал потребление кислорода, тогда как отношение АТФ к АДФ снижалось.

Клинические данные показывают то же самое. Метгемоглобинемию лечат примерно одним–двумя миллиграммами метиленового синего на килограмм массы тела внутривенно, через NADPH-зависимый путь восстановления, а большие дозы вызывают состояние, которое лечат. В том же обзоре отмечается, что эффект антидота максимален в неповреждённых эритроцитах и снижается при наличии гемолиза, что является повторением наблюдения о гемолизе 1930 года семьдесят три года спустя в больничном контексте. Соединение, у которого полезные и вредные эффекты находятся по разные стороны пороговой дозы, не является соединением, дозу которого следует выводить из измерения потребления кислорода.

Почему партия имеет значение

Харроп и Баррон заметили деталь, заслуживающую повторного рассмотрения. Сам метиленовый синий создаёт полосу в спектроскопе между двумя характерными полосами метгемоглобина, "что может легко вызвать путаницу при поверхностном осмотре". Краситель может имитировать вещество, которое исследуют.

Та же проблема имеет химическую форму. Родственный фенотиазин, присутствующий как незначительная примесь, обладает собственным окислительно-восстановительным поведением, собственной проницаемостью и собственной токсичностью. Один документированный случай показывает важность этого: в исследовании йодирования метиленового синего образцы, содержащие примерно 7–8 процентов Azure B, производили главным образом йодированный Azure B, поэтому именно примесь, а не метиленовый синий, определяла реакцию.

Любой, кто использует метиленовый синий как реагент, в лаборатории, на стол