مقاله
د مایکروسکوپۍ لپاره د میتیلین بلو بدیلونه: د کار له مخې یې وټاکئ
د باکتریاوو د ساده سمیر لپاره، کله چې موخه د حجرو د شکل لیدل وي، کریسټال وایلیټ د میتیلین بلو پر ځای کارېدلی شي. د ژوندیو حجرو لپاره، ښايي غوره بدیل فېز کانټراسټ وي، بې له دې چې هېڅ رنګ وکارول شي. انتخاب په هغه مشاهده پورې اړه لري چې ترسره کول یې غواړئ.
فرض کړئ دوه کسان د باکتریاوو هماغه کلتور ګوري. یو غواړي میلهنما حجرې له ګردو حجرو جلا وپېژني. بل غواړي پوه شي چې ایا یوې درملنې باکتریاوې وژلې دي که نه. هغه رنګ چې لومړي کس ته روښانه انځور ورکوي، ښايي دویم کس ته د کار وړ ځواب ورنه کړي.
د بدیل له ټاکلو مخکې، دا جمله بشپړه کړئ: “زه باید ___ په ___ کې مشاهده کړم، او حجرې باید / اړتیا نه لري چې ژوندۍ پاتې شي.” همدا جمله هغه دنده تعریفوي چې رنګ یې باید ترسره کړي.
له نمونې او پوښتنې څخه پیل وکړئ
لومړی پرېکړه وکړئ چې حجرې باید ژوندۍ پاتې شي که نه، بیا هغه ځانګړنه مشخصه کړئ چې مشاهده کول یې غواړئ:
- حجرې باید ژوندۍ پاتې شي: د حرکت یا شکل لپاره، بېرنګولو فېز کانټراسټ یا DIC په پام کې ونیسئ؛ د هستوي DNA لپاره، د فلوروسینس سره Hoechst 33342 په پام کې ونیسئ؛ د غشا د بشپړتیا لپاره، یو تایید شوی ازموینیز میتود لکه SYTO 9 د propidium iodide سره وټاکئ.
- اړتیا نشته چې حجرې ژوندۍ پاتې شي: د باکتریايي مورفولوژۍ لپاره، د کریسټال وایلیټ ساده رنګول یا د نایګروسین منفي رنګول په پام کې ونیسئ؛ د Gram غبرګون لپاره، د Gram-rنګولو بشپړه طریقه وکاروئ؛ په ثابتو حجرو کې د هستوي DNA لپاره، DAPI فلوروسینس په پام کې ونیسئ. د هرې لارې د محدودیتونو د پرتله کولو لپاره دا جدول وکاروئ. دا د طریقې انتخابونه دي، نه دا لارښوونې چې په موجود پروتوکول کې یو بوتل له بل سره بدل کړئ.
| څه شی باید مشاهده کړئ | نمونه او تجهیزات | احتمالي بدیل | اصلي محدودیت |
|---|---|---|---|
| د باکتریاوو شکل او ترتیب | چمتو شوی باکتریايي سمیر؛ brightfield | د کریسټال وایلیټ ساده رنګول | مورفولوژي ښيي؛ د Gram غبرګون یا ژوندي پاتې کېدل نه ثابتوي. |
| د حجرو څنډې د تیاره شالید پر وړاندې | باکتریولوژیکي چمتووالی؛ brightfield | د نایګروسین منفي رنګول | چمتووالی او فورمول مهم دي؛ بېرنګ شوې حجره لازماً ژوندۍ نه وي. |
| Gram غبرګون | چمتو شوی باکتریايي سمیر؛ brightfield | د Gram-rنګولو بشپړه طریقه | د ریجنټونو بشپړ تسلسل او کنټرولونو ته اړتیا لري. |
| د ژوندیو حجرو حرکت یا بدلونونه | مناسب لوند چمتووالی؛ phase contrast یا DIC | هېڅ رنګ نه | مناسبو اپټیکونو ته اړتیا لري؛ کانټراسټ یو مالیکول نه پېژني. |
| هستوي DNA | ثابتې حجرې؛ فلوروسینس | DAPI | د excitation او emission مناسبو فلټرونو ته اړتیا لري. |
| په ژوندیو حجرو کې هستوي DNA | ژوندۍ حجرې؛ فلوروسینس | Hoechst 33342 | حجرې ته ننوتل دا نه ثابتوي چې د انځور اخیستنې شرایط بېزیانه دي. |
| د باکتریايي غشا بشپړتیا | ناثابتې باکتریاوې؛ فلوروسینس | SYTO 9 د propidium iodide سره | د غشا رنګول د ژوندي پاتې کېدو غیرمستقیمه اندازه ده. |
د ساده سمیر لپاره، طریقه په احتیاط بدله کړئ
کله چې دنده د باکتریايي مورفولوژۍ یو رنګه انځور وي، کریسټال وایلیټ یو عملي انتخاب دی. د FDA د Bacteriological Analytical Manual په لارښود کې د کریسټال وایلیټ دوه فورمولونه چې د ساده رنګولو لپاره مناسب دي ذکر شوي دي. مستند فورمول او د هغه د چمتو کولو طریقه وکاروئ؛ یوازې د رنګ نوم د کار وړ ریجنټ نه مشخصوي.
کریسټال وایلیټ په Gram رنګولو کې هم کارېږي، خو دا مانا نه لري چې د کریسټال وایلیټ ساده رنګول د Gram رنګول دي. د ASM Gram-rنګولو پروتوکول کې، تفریقي پایله په دې پورې اړه لري چې کریسټال وایلیټ، آیودین، بېرنګول، او مقابل رنګول په تسلسل سره عمل وکړي. د دغو پړاوونو پرېښودل هغه څه بدلوي چې انځور یې ثابتولی شي. د دې توپیر لپاره ساده رنګول او Gram رنګول وګورئ.
نایګروسین د څنډو د څرګندولو بله لاره وړاندې کوي: دا شالید تیاره کوي، په داسې حال کې چې باکتریايي حجرې نسبتاً روښانه پاتې کېږي. د Merck د نایګروسین په لارښوونو کې یو مهم جزئیات شته چې د بدیلونو په عمومي لېست کې له پامه غورځېدای شي. د دې ټاکل شوی کاري فورمول formaldehyde لري. له همدې امله، یوازې د “منفي رنګ” له کلمو څخه د ژوندیو حجرو سره د سازګارۍ پایله نشئ اخیستلای، که څه هم حجرې په خپله بېرنګ ښکاري. بشپړ فورمول او د نمونې چمتووالی وګورئ.
د ژوندیو نمونو لپاره، د اپټیک بدلول په پام کې ونیسئ
که غواړئ د حجرو حرکت یا وېشل وګورئ، د بل رنګ ورزیاتول ښايي مشاهده پېچلې کړي. لکه څنګه چې Nikon د شفافو نمونو د کانټراسټ په لارښود کې تشریح کوي، phase contrast او differential interference contrast، یا DIC، نمونې د هغوی په نوري ځانګړنو کې د توپیرونو له لارې د لیدلو وړ کوي. که مایکروسکوپ اړینې برخې ولري، دا طریقې ژوندۍ او بېرنګ شوې حجرې ښکاره کولی شي.
دا انتخاب نمونه بېرنګ ساتي، خو موجود معلومات بدلوي. تاسو یوه څنډه یا حرکت تعقیبولی شئ، بې له دې چې پوه شئ کوم مالیکول کانټراسټ رامنځته کړی. که پوښتنه د مالیکولي موقعیت په اړه وي، پر ځای یې د نښه کولو مناسبه طریقه وټاکئ.
د هستوي DNA لپاره، د Invitrogen د DAPI او Hoechst رنګونو پرتله د DAPI عام استعمال له ثابتو حجرو سره د Hoechst 33342 له زیاتې حجرهننوتونکې ځانګړنې سره توپیر کوي، چې د ژوندیو حجرو د نښه کولو لپاره غوره ګڼل کېږي. دواړه د فلوروسینس تجهیزاتو ته اړتیا لري. هېڅ یو یې د رنګه brightfield رنګ مستقیم بدیل نه دی.
د رنګ تماس او روښانتیا د تجربوي شرایطو په توګه وڅېړئ. کله چې د حجرو چلند ستاسو اندازه وي، رنګ شوې او بېرنګ شوې چمتو شوې نمونې سره پرتله کړئ.
سره حجره په اتومات ډول مړه حجره نه ده
SYTO 9 او propidium iodide ډېری وخت د باکتریايي غشا د بشپړتیا د ارزونې لپاره یوځای کارول کېږي. د BacLight لارښود سالمې غشاګانې له شنه رنګولو او زیانمنې غشاګانې له سره رنګولو سره تړي. دا تفسیر د نمونې لپاره تایید ته اړتیا لري.
د Rosenberg او همکارانو د 2019 مطالعې پایلې دا ستونزه روښانه کوي. په phosphate-buffered saline کې، پر ښیښه د 24-hour E. coli biofilms کې، شاوخوا 96% حجرې په خپل ځای کې propidium-iodide-positive ښکاره شوې. خو لیکوالانو اټکل وکړ چې له راټولولو وروسته 82% د کلتور وړ وې. Confocal انځورونو د سره رنګ شوي موادو لاندې داسې حجرې وښودلې چې دننه شنې وې، چې دا په ګمراه کوونکي سیګنال کې د حجرو څخه بهر nucleic acids ښکېلتیا ته اشاره کوي.
دا سلنې د مطالعې پر چمتو شویو نمونو د بېلابېلو اندازو تشریح کوي، نه یو نړیوال سمون فکتور. ګټور درس دا دی چې وګورئ سیګنال څه شي رامنځته کړی. په biofilm کې، د nucleic-acid رنګ کولی شي د زیانمنو حجرو دننه موادو تر څنګ د حجرو بهر مواد هم ومومي. د ژوندي پاتې کېدو د پایلې لپاره، څېړونکي د تکمیلي اندازو سپارښتنه کوي، لکه کلتور یا میتابولیک فعالیت، او په ورته وخت کې مني چې هره طریقه محدودیتونه لري.
وګورئ چې بدیل په حقیقت کې څه لري
د رنګولو یوه بدیله طریقه بیا هم میتیلین بلو لرلی شي. Giemsa یوه بېلګه ده: Merck خپل محصول د azure-eosin-methylene-blue محلول په توګه تشریح کوي، چې د وینې او هډوکي ماغزو د سمیرونو په ګډون د کارونو لپاره جوړ شوی. دا د بلې نمونې لپاره یوه بېله طریقه کېدای شي، خو د میتیلین بلو د بشپړ حذف اړتیا نه پوره کوي.
که د یوه مرکب حذف د تجربې برخه وي، د انځورونو له پرتله کولو مخکې د ریجنټ هویت او فورمول وګورئ. د methyl blue، methylene blue، او ورته نوم لرونکو رنګونو لارښود د نومونو توپیرونه تشریح کوي.
د پایلې له کارولو مخکې بدلون تایید کړئ
د یوې نوې طریقې لپاره، د استازو نمونو او مناسب کنټرول په کارولو سره یوه کوچنۍ پرتله ترسره کړئ. چېرته چې ممکن وي، د مایکروسکوپ تنظیمات د پرتله کېدو وړ وساتئ. د ریجنټ فورمول، د نمونې چمتووالی، تماس، او د انځور اخیستنې شرایط ثبت کړئ، څو یو ظاهراً غوره انځور وڅېړل شي، نه دا چې یوازې غوره وګڼل شي.
بریا د اصلي پوښتنې پر بنسټ وارزوئ. د مورفولوژۍ لپاره، وګورئ چې ایا د حجرو څنډې او ترتیب لا هم د تفسیر وړ دي. د هستوي نښه کولو لپاره، د سیګنال موقعیت او شالید وارزوئ. د ژوندي پاتې کېدو لپاره، یوازې پر زړهراښکونکي رنګي جلاوالي تکیه مه کوئ او نور شواهد وغواړئ. د میتیلین بلو رنګولو او لابراتواري کارونو پراخ لارښود تشریح کوي چې مشاهده او چمتووالی څنګه یو له بل سره تړاو لري.
هغه بدیل وټاکئ چې هغه اندازه وساتي چې تاسو ورته اړتیا لرئ. رنګ یوازې د پایلهيي انځور یوه ځانګړنه ده.