Błękit metylenowy a ATP: czy większe zużycie tlenu oznacza więcej energii?

Wyizolowane mitochondrium znajduje się w komorze z paliwem, ale bez ADP. Powoli zużywa tlen. Po dodaniu ADP zużycie tlenu wzrasta kilkukrotnie. Gdy ADP się wyczerpie, zużycie tlenu ponownie spada. Paliwo się nie zmieniło. Zmieniło się tylko zapotrzebowanie na ATP.

Ta krótka sekwencja ilustruje całe rozróżnienie, któremu poświęcony jest ten artykuł. Zużycie tlenu mierzy szybkość przepływu elektronów przez łańcuch oddechowy do tlenu. Produkcja ATP mierzy, jaka część tego przepływu zostaje przechwycona w postaci użytecznej energii. Oba procesy łączy etap pośredni: gradient protonowy w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Wszystko, co zmienia stopień sprzężenia tego gradientu z syntezą ATP, może skierować oba parametry w różne strony. Błękit metylenowy dobrze ilustruje tę zależność, ponieważ zaobserwowano oba rodzaje jego działania: w niektórych preparatach zwiększał zużycie tlenu wraz z ATP, a w innych zwiększał zużycie tlenu, podczas gdy ATP pozostawało bez zmian lub spadało.

Czytelnicy, którzy chcą najpierw poznać szerszy obraz przekazywania elektronów, mogą zacząć od tego, jak błękit metylenowy przenosi elektrony przez łańcuch oddechowy. Ci, którzy chcą poznać terminologię wczesnych eksperymentów dotyczących tlenu, mogą przeczytać, co rzeczywiście wykazały pierwsze pomiary oddychania.

Oddychanie, ATP i gradient między nimi

Elektrony z NADH i FADH2 trafiają do łańcucha przez kompleksy I i II, przechodzą przez kompleks III do cytochromu c, a następnie przez kompleks IV do tlenu. Energia uwalniana w kompleksach I, III i IV napędza pompowanie protonów z macierzy do przestrzeni międzybłonowej. To rozdzielenie ładunku i kwasowości tworzy siłę protonomotoryczną, której składowa elektryczna, czyli potencjał błonowy, zwykle dominuje.

Syntaza ATP umożliwia powrót protonów do macierzy i wykorzystuje uwalnianą energię do połączenia ADP i fosforanu w ATP. Zatem kolejność jest następująca:

zużycie tlenu, następnie pompowanie protonów, następnie gradient, następnie synteza ATP.

Problem polega na tym, że protony mogą wracać także innymi drogami. Każdy powrót z pominięciem syntazy ATP to przeciek protonowy. Przeciek zmusza łańcuch do ponownego pompowania tych samych protonów, aby utrzymać stały potencjał błonowy. Powoduje to większe zużycie tlenu bez wytwarzania większej ilości ATP. Dostatecznie silny przeciek oznacza rozprzężenie: zużycie tlenu rośnie, podczas gdy ATP pozostaje bez zmian lub spada, a niewykorzystana energia jest uwalniana jako ciepło.

Stan 3, stan 4 i współczynnik kontroli oddechowej

Klasyczna terminologia opisująca te zjawiska pochodzi z badań wyizolowanych mitochondriów. Stan 3 to oddychanie w obecności substratu i ADP: syntaza ATP zużywa gradient, potencjał błonowy spada, a łańcuch przyspiesza, aby go odbudować. Zużycie tlenu jest wysokie, ponieważ powstaje ATP. Stan 4 to oddychanie po wyczerpaniu ADP: syntaza ATP przestaje pracować, gradient rośnie, wysoki potencjał błonowy utrudnia dalsze pompowanie, a zużycie tlenu spada do poziomu potrzebnego do kompensowania przecieku.

Współczynnik kontroli oddechowej, czyli stosunek oddychania w stanie 3 do oddychania w stanie 4, pokazuje więc, jak silnie sprzężony jest dany preparat. Wysoki współczynnik oznacza, że ADP silnie kontroluje oddychanie. Spadek współczynnika przy wzroście oddychania w stanie 4 oznacza, że zaczyna dominować przeciek. To właśnie w tym świetle należy rozpatrywać poniższe wyniki dotyczące błękitu metylenowego.

Warto zapamiętać jeden model myślowy. Wysoki potencjał błonowy spowalnia łańcuch. Rozpraszanie potencjału go przyspiesza. Łańcuch reaguje na to, jak trudne stało się pompowanie, a nie bezpośrednio na to, czy powstaje ATP.

Kiedy oba parametry zmieniają się razem

Najwyraźniejszy przykład sprzężenia pochodzi z badania wyizolowanych mitochondriów mózgu świnki morskiej z zablokowanymi kompleksami oddechowymi. Przy stężeniach błękitu metylenowego od 100 nanomoli na litr do 1 mikromola na litr spoczynkowe zużycie tlenu rosło, gdy paliwem były glutaminian z jabłczanem, bursztynian lub glicerofosforan, natomiast oddychanie stymulowane przez ADP pozostawało bez zmian. W mitochondriach z zahamowanym kompleksem I lub kompleksem III barwnik nieznacznie zwiększał produkcję ATP, przywracał potencjał błonowy i poprawiał wychwyt wapnia. Proponowana droga jest skrótem: barwnik przyjmuje elektrony przed miejscem blokady i przekazuje je cytochromowi c, omijając uszkodzony kompleks.

Drugi przypadek wspólnych zmian wykorzystuje zupełnie inne źródło ATP. W wyizolowanych mitochondriach mózgu z zahamowaną syntazą ATP błękit metylenowy nadal stymulował oddychanie na każdym badanym substracie. Jednak synteza ATP wzrastała tylko przy alfa-ketoglutaranie i glutaminianie, czyli dwóch substratach, z których powstaje sukcynylo-CoA. Gdy oligomycyna blokowała syntazę ATP, dodatkowe ATP pochodziło z fosforylacji substratowej katalizowanej przez ligazę sukcynylo-CoA w cyklu kwasu cytrynowego, a nie z fosforylacji oksydacyjnej. Barwnik przywracał również potencjał błonowy, gdy jednocześnie hamowano kompleks I i syntazę ATP. W tym przypadku zużycie tlenu i ATP zmieniały się razem, ale tylko tam, gdzie substrat umożliwiał działanie drugiego szlaku wytwarzania ATP. Przy bursztynianie lub jabłczanie oddychanie rosło bez dodatkowego ATP. Ten sam barwnik, ta sama komora, inne paliwo, inny wynik.

Kiedy oba parametry się rozchodzą

Przypadki rozbieżności również zostały opublikowane i są równie pouczające. W badaniu wyizolowanych mitochondriów wątroby szczura z 1997 roku błękit metylenowy przyspieszał oddychanie w stanie 4 w silnie sprzężonych mitochondriach wykorzystujących bursztynian, co obniżało współczynnik kontroli oddechowej. Efekt był widoczny od 0.5 mikromola na litr i silny przy 5 mikromolach na litr, czyli stężeniu zbliżonym do poziomów w osoczu po dożylnym bolusie 100 miligramów. Przy 5 mikromolach na litr mitochondria również pęczniały, choć zaburzenie sprzężenia pojawiało się wcześniej, przy niższych stężeniach. Wskazuje to, że przeciek poprzedzał uszkodzenia strukturalne, a nie wynikał z nich. W rozprzężonych mitochondriach barwnik stymulował oddychanie w sposób zależny od stężenia i podlegający nasyceniu. Zużycie tlenu rosło w obu preparatach. Synteza ATP w przeliczeniu na zużyty tlen nie rosła. To podręcznikowy przykład rozprzężenia i przenoszenia elektronów przez tę samą cząsteczkę.

Najbardziej uderzająca rozbieżność pochodzi z badań siatkówki. U myszy z niedoborem AIF oraz w komórkach fotoreceptorowych poddanych działaniu rotenonu błękit metylenowy zachowywał grubość siatkówki, markery fotoreceptorów i strukturę mitochondriów, a także obniżał stosunek NADH do NAD oraz wyciszał szlaki odpowiedzi na stres, w tym odpowiedź na niesfałdowane białka i mitofagię. Działo się to bez wyrównania niedoboru ATP. Ochrona bez przywrócenia poziomu energii oznacza, że korzyść wynikała z równowagi redoks i integralności mitochondriów, a nie z dodatkowego ATP. Każdy, kto utożsamiałby przetrwanie tkanki z przywróceniem produkcji energii, całkowicie błędnie odczytałby ten eksperyment.

Badania mitochondriów mózgu dodają do tego bilansu pozycję kosztów. Te same niskie stężenia, które poprawiały bioenergetykę, zwiększały również wytwarzanie nadtlenku wodoru we wszystkich badanych warunkach i spowalniały jego usuwanie. Mierzono to za pomocą skalibrowanego testu Amplex, a nie nieswoistego barwnika. Więcej ATP i więcej utleniacza pojawiało się razem.

Praktyczna lista kontrolna przy lekturze

Cztery pytania pozwalają odróżnić wynik związany ze sprzężeniem od wyniku związanego z rozprzężeniem.

Po pierwsze, jaki parametr rzeczywiście zmierzono. Samo zużycie tlenu nie mówi o ATP. Synteza ATP, potencjał błonowy i współczynnik kontroli oddechowej dostarczają informacji, których elektroda tlenowa nie może zarejestrować. Przewodnik po interpretowaniu twierdzeń z badań nad błękitem metylenowym szczegółowo omawia tę dyscyplinę rozróżniania mierzonych parametrów.

Po drugie, jaki substrat zasilał mitochondria. Wynik dotyczący sukcynylo-CoA pokazuje, że wybór paliwa może decydować o tym, czy dodatkowe oddychanie w ogóle może przełożyć się na dodatkowe ATP.

Po trzecie, jakiego stężenia użyto. Błękit metylenowy w stężeniach od nanomolowych do niskich mikromolowych w mitochondriach mózgu dawał niewielkie korzyści bioenergetyczne kosztem większej ilości utleniacza; pół mikromola na litr i więcej w mitochondriach wątroby osłabiało sprzężenie; przy 5 mikromolach na litr dodatkowo pojawiało się pęcznienie. Stężenie jest częścią mechanizmu, a nie drugorzędnym szczegółem.

Po czwarte, w jakim modelu uzyskano wynik. Wyizolowane mitochondria ujawniają połączenia między elementami układu, ale w całych komórkach i tkankach dochodzą transport, redukcja do bezbarwnej postaci oraz konkurencyjne drogi odbierające elektrony. Prace nad dawkowaniem laboratoryjnym, w tym nad wpływem stężenia i protokołu na działanie błękitu metylenowego, stanowią pomost między liczbami uzyskanymi w komorze a jakimkolwiek twierdzeniem dotyczącym człowieka.

Zużycie tlenu informuje o przepływie elektronów. ATP informuje o tym, jaka część tego przepływu została przechwycona. Błękit metylenowy może zmieniać każdy z tych parametrów, a powyższe eksperymenty pokazują wszystkie cztery wynikające z tego kombinacje: oba rosną, oddychanie rośnie tylko tam, gdzie pozwala na to substrat, oddychanie rośnie przy słabnącym sprzężeniu, a tkanka zostaje zachowana, podczas gdy ATP pozostaje bez zmian. Odczyt z elektrody tlenowej jest początkiem interpretacji, a nie jej końcem.