Błękit metylenowy i Bartonella: wyniki laboratoryjne i ograniczenia dowodów klinicznych

Hodowlę na szalce i pacjenta łączy słowo „zakażenie”, ale nie kryjące się za nim pojęcie. Na szalce zakażenie oznacza liczbę kolonii na agarze. U pacjenta oznacza bakterie wewnątrz komórek i naczyń, leki przemieszczające się przez krew i tkanki oraz układ odpornościowy wykonujący część pracy. Gdy pomylimy te dwa konteksty, imponujący wynik laboratoryjny zaczyna wyglądać jak metoda leczenia. Gdy je rozdzielimy, ta sama liczba staje się tym, czym jest: powodem do przeprowadzenia kolejnego eksperymentu.

Właśnie to rozróżnienie jest głównym zadaniem tego przeglądu dotyczącego błękitu metylenowego i Bartonella. W dwóch badaniach laboratoryjnych przeprowadzonych przez jedną grupę badawczą testowano błękit metylenowy przeciwko Bartonella henselae w stanach bez wzrostu. W obu stwierdzono silną aktywność w szklanych i plastikowych naczyniach. W żadnym nie badano ludzi.

Dlaczego badacze testują fazę stacjonarną

Większość testów antybiotyków wykorzystuje rosnące komórki. Ten model pomija trudniejszy przypadek: komórki, które przestały się dzielić i tolerują leki zabijające ich rosnące odpowiedniki.

Bartonella może utrzymywać się w organizmie, także wewnątrz erytrocytów i komórek śródbłonka. Grupa zadała więc pytanie, które zatwierdzone leki mogą zabijać B. henselae po wejściu w fazę stacjonarną. Niskie MIC wobec rosnących komórek nie pozwalało przewidzieć zabijania komórek w fazie stacjonarnej. Ryfampicyna miała bardzo niskie MIC, ale słabo zabijała komórki w fazie stacjonarnej, podczas gdy związki o wyższych wartościach MIC zabijały je skutecznie. Czytelnicy szukający ogólnej metody analizy takich publikacji znajdą ją w przewodniku po czytaniu badań nad błękitem metylenowym.

Pierwsze badanie przesiewowe: Li i współpracownicy, 2019

W badaniu przesiewowym fazy stacjonarnej z 2019 roku w Antibiotics wykorzystano jeden szczep, B. henselae JK53, hodowany na podłożu Schneidera z 10 procent płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 C przy 5 procent CO2. Jednodniowe hodowle składały się głównie z rozproszonych, dzielących się komórek. Pięciodniowe hodowle, o liczebności około 10 do potęgi 8 jednostek tworzących kolonie na mL, uznano za będące w fazie stacjonarnej; zawierały one widoczne agregaty.

W teście wykorzystano SYBR Green I z jodkiem propidyny, a kalibrację przeprowadzono na mieszaninach żywych komórek i komórek zabitych izopropanolem. Ponieważ błękit metylenowy jest silnie zabarwiony, obiecujące wyniki potwierdzano mikroskopowo, a następnie przez zliczanie kolonii na agarze z krwią — bardziej rygorystyczny punkt końcowy.

Spośród 1,581 zatwierdzonych leków badanych przy stężeniu 50 mikromoli na litr błękit metylenowy pozostawił 16 procent żywotnych komórek według czytnika płytek i 25 procent według oceny mikroskopowej. Daptomycyna uzyskała wynik 21 procent, kilka azoli od 22 do 27 procent, gentamycyna 32 procent, erytromycyna 66 procent, a cyprofloksacyna 74 procent. Embonian pyrwinium wydawał się silniejszy w odczycie czytnika, ale jego własna fluorescencja uniemożliwiała ocenę mikroskopową.

Wobec rosnącej B. henselae MIC błękitu metylenowego wynosiło od 0.08 do 0.16 mikrogramów na mL. W przypadku pięciodniowych komórek w fazie stacjonarnej przy stężeniu 5 mikrogramów na mL po jednym dniu ekspozycji nie wykryto żadnych kolonii, podobnie jak dla daptomycyny i embonianu pyrwinium przy badanych stężeniach. W osobnym badaniu kinetyki zabijania zastosowano 10 mikrogramów na mL. Są to poziomy ekspozycji laboratoryjnej, nie dawki, i tak też przedstawiono je w publikacji. Przywołane maksymalne stężenie w osoczu człowieka, wynoszące około 3.9 mikrogramów na mL, pojawia się w pracy wyłącznie jako kontekst. Przegląd farmakokinetyki błękitu metylenowego wyjaśnia, dlaczego wartości stężenia w osoczu nie można interpretować jako wartości stężenia w tkankach.

W publikacji wyraźnie wskazano dwa ograniczenia. Nie zastosowano modelu biofilmu ani nie testowano połączeń z błękitem metylenowym. Pięciodniowe agregaty były skupiskami w płynnej hodowli w fazie stacjonarnej, a nie zwalidowanym eksperymentem z biofilmem. Autorzy wskazali potrzebę badań na zwierzętach, badań połączeń leków i biofilmu oraz testów na innych gatunkach Bartonella.

Połączenia leków i komórki pochodzące z biofilmu: Zheng i współpracownicy, 2020

W badaniu uzupełniającym z 2020 roku w BMC Microbiology zachowano ten sam szczep i podłoże, ale zastosowano sześciodniowe hodowle w fazie stacjonarnej i dodano dwa elementy, których brakowało w pierwszej pracy: połączenia dwóch leków oraz model komórek pochodzących z biofilmu.

Przy stosowaniu pojedynczych leków w jednakowym stężeniu 5 mikrogramów na mL przez 24 godziny błękit metylenowy pozostawił 3.2 razy 10 do potęgi 4 jednostek tworzących kolonie na mL, wobec około 2.8 razy 10 do potęgi 10 w kontroli. Cyprofloksacyna, gentamycyna i nitrofurantoina pozostawiły mniej kolonii w tym samym punkcie czasowym. Różni się to od wyniku z 2019 roku, kiedy przy tym samym nominalnym stężeniu po jednym dniu nie wykryto żadnych kolonii. Wiek hodowli, jej gęstość i sposób postępowania z nią były inne, więc efekt zabijania był powtarzalny co do kierunku, ale nie identyczny co do wielkości. Ta zmienność między seriami eksperymentów jest jednym z powodów, dla których standardowa ocena bezpieczeństwa i interakcji traktuje siłę działania w laboratorium oddzielnie od efektu klinicznego.

Badanie przesiewowe połączeń leków jest najczęściej cytowaną częścią pracy. Stężenie każdego składnika ustalono na 5 mikrogramów na mL. Zarówno azytromycyna z błękitem metylenowym, jak i ryfampicyna z błękitem metylenowym po 24 godzinach nie pozostawiły żadnych wykrywalnych kolonii z fazy stacjonarnej, podobnie jak oba połączenia z cyprofloksacyną. Dotyczyło to wyłącznie tych czterech spośród 25 badanych par. Nie przeprowadzono formalnej analizy synergii, dlatego właściwym określeniem jest „aktywne połączenie w tych warunkach”, a nie „udowodniona synergia”.

W eksperymencie z biofilmem badano komórki odzyskane z młodego, rozbitego biofilmu, a nie przenikanie do nienaruszonego, dojrzałego biofilmu. Hodowle prowadzono przez pięć dni, rozcieńczano i przenoszono do płytek z dołkami na kolejne pięć dni, potwierdzano obecność biofilmu barwieniem fioletem krystalicznym, a następnie zeskrobywano go przed ekspozycją na leki. Przy stężeniu 5 mikrogramów na mL sam błękit metylenowy zmniejszył liczbę kolonii do 2.3 razy 10 do potęgi 2 do dnia 6, co należało do najlepszych wyników dla pojedynczych substancji, ale nie oznaczało zera. Oba połączenia z błękitem metylenowym osiągnęły zero do dnia 6, podobnie jak oba połączenia z cyprofloksacyną.

Autorzy wskazali te same ograniczenia, które dostrzegłby uważny czytelnik: młody, zeskrobany biofilm zamiast starego i nienaruszonego; jedno wygodne stężenie dla wszystkich leków zamiast realistycznego maksymalnego stężenia właściwego dla każdego leku; tylko wybrane pary oparte na azytromycynie lub ryfampicynie; jeden szczep; brak zwierząt i pacjentów. Dalsze badania połączeń trzech leków zaproponowano, ale nie przedstawiono ich wyników.

Porównanie projektów badań

Tabela przedstawia sedno tego artykułu w zwartej formie. Wszystko na lewo od ostatniej kolumny dotyczy badań hodowli. Żadna z publikacji nie dostarcza danych należących do ostatniej kolumny.

Bartonella to nie Borrelia

Obie publikacje wspominają o Borrelia burgdorferi, krętku wywołującym boreliozę, ponieważ test z barwnikami wywodził się z wcześniejszych badań nad fazą stacjonarną Borrelia prowadzonych w tym samym laboratorium, w których błękit metylenowy i daptomycyna również uzyskały obiecujące wyniki. Ta historia stanowi przydatny kontekst, ale jest też częstym źródłem błędów.

W żadnym eksperymencie opisanym w obu publikacjach dotyczących Bartonella nie badano Borrelia równolegle z Bartonella. Organizmy, podłoża i stężenia są różne, a hipotetyczne działanie błękitu metylenowego na błonę komórkową Bartonella przedstawiono jako przypuszczenie wymagające dalszych badań. Wyników nie należy przenosić między gatunkami, a żadna z publikacji nie uzasadnia szerokich twierdzeń dotyczących pasożytów. Z tego powodu porównanie komórek przetrwałych Borrelia i Bartonella rozdziela literaturę dotyczącą tych dwóch organizmów.

Dlaczego hodowle nie przekładają się na schemat leczenia

Zainteresowanie wyszukiwaniem schematu stosowania błękitu metylenowego przeciwko Bartonella jest zrozumiałe. Te publikacje pokazują jednak, dlaczego takie hasło należy traktować jako sygnał ostrzegawczy, a nie listę zakupów.

Po pierwsze, 5 mikrogramów na mL w dołku płytki nie jest zaleceniem dotyczącym leczenia. Z tą wartością nie wiążą się żadne dane o wchłanianiu, dystrybucji, wiązaniu z białkami, przenikaniu do komórek ani tolerancji. Autorzy wybrali ją jako przybliżoną średnią maksymalnych stężeń antybiotyków i stwierdzili, że przyszłe badania powinny wykorzystywać realistyczne stężenie właściwe dla każdego leku.

Po drugie, zero kolonii oznacza brak kolonii w danych warunkach posiewu, a nie jałową tkankę. Komórki przetrwałe, bakterie wewnątrzkomórkowe i ograniczenia pobierania próbek pozostają poza tym, co można ocenić na płytce agarowej.

Po trzecie, połączenia, które wyjaławiają dołek płytki, mogą zawieść lub zaszkodzić w organizmie. Azytromycyna z błękitem metylenowym i ryfampicyna z błękitem metylenowym to laboratoryjne pary stosowane przy laboratoryjnych poziomach ekspozycji. Bez danych farmakokinetycznych ze zwierząt i kontrolowanych badań u ludzi nie ma ustalonej dawki, czasu stosowania ani stosunku korzyści do ryzyka. Każdy, kto rozważa dostępne możliwości, powinien omówić je z lekarzem i zapoznać się z tym, kiedy stosowanie błękitu metylenowego wymaga nadzoru medycznego, zanim wyciągnie jakiekolwiek wnioski z danych uzyskanych na szalkach.

Wąski wniosek, który te publikacje rzeczywiście uzasadniają, brzmi następująco: błękit metylenowy wykazuje powtarzalną aktywność wobec nierosnącej B. henselae JK53 in vitro, także w laboratoryjnych połączeniach dwóch leków, przy czym najsilniejsze wyniki dotyczące połączeń i komórek pochodzących z biofilmu pochodzą z badania z 2020 roku. Wszystko inne, w tym to, czy ta aktywność ma znaczenie dla bartonelozy u ludzi, pozostaje niezbadane.