Błękit metylenowy w badaniach udaru i hipoperfuzji mózgowej: co naprawdę pokazują trzy modele

Zablokowana tętnica, hodowla komórkowa pozbawiona składników odżywczych i szczur ze zwężonymi tętnicami szyjnymi brzmią jak trzy wersje jednego eksperymentu. Tak jednak nie jest. Każdy z nich odpowiada na inne pytanie, a błękit metylenowy daje w każdym inną odpowiedź. Gdy się je ze sobą miesza, literatura wydaje się sprzeczna. Gdy się je rozdzieli, pojawia się wyraźny wzorzec, zależny głównie od momentu podania.

Właśnie to rozróżnienie jest celem niniejszego przeglądu. Te trzy modele to ostry udar ogniskowy, pozbawienie tlenu i glukozy z ponownym natlenieniem komórek w hodowli oraz przewlekła hipoperfuzja mózgowa trwająca tygodniami. Proponowany mechanizm, który je łączy, dotyczy mitochondriów, ale wyniki są różne, ponieważ różny jest kontekst metaboliczny.

Trzy modele odpowiadają na różne pytania

Ostry udar ogniskowy u szczurów zwykle wywołuje się przez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu, w skrócie MCAO. Zablokowanie przypominające działanie skrzepu tworzy rdzeń niedokrwienny otoczony penumbrą — tkanką zagrożoną, ale potencjalnie możliwą do uratowania, jeśli przepływ zostanie przywrócony. Pytanie brzmi tu: czy interwencja spowalnia powiększanie się ogniska zawałowego lub zachowuje funkcje w okresie reperfuzji.

Pozbawienie tlenu i glukozy, w skrócie OGD, działa na zupełnie innej skali. Hodowane komórki mózgowe umieszcza się w warunkach niemal zerowej dostępności tlenu i bez glukozy, a następnie przywraca się im standardową pożywkę. Nie ma tu skrzepu, krążenia obocznego, ciśnienia krwi ani układu odpornościowego. Pytanie jest czysto komórkowe: co dzieje się z oddychaniem, ATP i przeżywalnością, gdy substraty znikają, a następnie wracają.

W modelu przewlekłej hipoperfuzji mózgowej stosuje się trwałe obustronne zamknięcie tętnic szyjnych u szczurów, nazywane modelem 2VO. Przepływ krwi do przodomózgowia spada i pozostaje niski przez tygodnie. Nie występuje nagły zawał ogniskowy ani ratunkowa reperfuzja. Pytanie brzmi: czy wielotygodniowe wsparcie metaboliczne pozwala zachować naczynia, mitochondria i pamięć podczas długotrwale obniżonego przepływu.

Poprawa pamięci po jednym miesiącu leczenia w modelu 2VO nie mówi więc niczego bezpośrednio o ratowaniu ludzkiego mózgu podczas ratunkowej trombektomii. To rozróżnienie ma znaczenie, ponieważ większość optymistycznych podsumowań je pomija.

Ostry udar: ochrona przy reperfuzji, opóźnienie bez niej

Najbardziej jednoznaczny wynik w ostrym udarze pochodzi z przejściowego MCAO z reperfuzją. U szczurów zamknięcie trwało 60 minut, po czym podawano im dożylnie błękit metylenowy w małej dawce, zaczynając w momencie reperfuzji, z kolejnymi dawkami po 3 godzinach i w dniu 2. Rezonans magnetyczny wykazał, że do dnia 2 zmiana w grupie otrzymującej sam nośnik powiększyła się o około 19 procent, podczas gdy w grupie leczonej zmniejszyła się o około 17 procent. Końcowe ogniska zawałowe były o około 30 procent mniejsze, a wyniki oceny neurologicznej lepsze w dniach 2 i 7. Obrazowanie wykazało lepsze przeżycie tkanki zarówno w rdzeniu, jak i w penumbrze. Szersza literatura dotycząca neuroprotekcji zestawia tę ochronę, uzyskaną dzięki podaniu w momencie reperfuzji, z wynikami badań nad niedokrwieniem globalnym i urazami.

Obraz zmienia się, gdy tętnica pozostaje zablokowana. W eksperymencie z trwałym MCAO błękit metylenowy podany podczas trwającego niedokrwienia spowalniał powiększanie się zmiany widocznej w obrazowaniu dyfuzyjnym i krótkotrwale wydłużał utrzymywanie się niezgodności perfuzyjno-dyfuzyjnej, przy nieco lepszym miejscowym przepływie. Końcowa objętość ogniska zawałowego po 24 godzinach nie różniła się jednak istotnie. Opóźniał on przejście zagrożonej tkanki w zawał, ale nie zastępował ponownego udrożnienia naczynia.

Trzecie badanie ostrego udaru uzupełnia ten obraz o mechanizm i znaczenie dawki. Pojedyncza dawka dootrzewnowa podana bezpośrednio po zamknięciu tętnicy przyniosła największe zmniejszenie ogniska zawałowego, o około 50 procent, przy pośredniej dawce 5 mg/kg, a nie przy 1 lub 10 mg/kg. Towarzyszyły temu lepsze wyniki oceny funkcji czuciowo-ruchowych. Autorzy powiązali ten efekt z zachowaniem struktury mitochondriów i nasileniem mitofagii, czyli selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Dawka, droga podania i schemat mają zatem znaczenie, a wartości w mg/kg stosowane u szczurów nie są dawkami do leczenia udaru u ludzi.

Hodowla komórkowa: ten sam lek pomaga lub szkodzi zależnie od momentu podania

Eksperyment z astrocytami jest najbardziej pouczający, a zarazem najczęściej błędnie przytaczany. Pierwotne astrocyty kory mózgowej myszy poddano przez 6 godzin silnemu pozbawieniu substratów przy 0.1 procent tlenu, w pożywce bez glukozy, pirogronianu i surowicy. Następnie przez 24 godziny prowadzono ponowne natlenienie po przywróceniu substratów. Około połowa komórek obumarła, co pozwalało wykazać w tym teście zarówno poprawę, jak i pogorszenie.

Gdy błękit metylenowy był obecny podczas fazy pozbawienia substratów, przeżywalność pogarszała się, zamiast poprawiać. Gdy wprowadzano go dopiero przy ponownym natlenieniu, niskie stężenia mikromolarne poprawiały żywotność oraz zwiększały zużycie tlenu, wychwyt glukozy i produkcję ATP. W normalnych warunkach te same stężenia zwiększały wychwyt glukozy o około 89 procent przy stężeniu 0.1 mikromolarnym i o około 200 procent przy stężeniu 1 mikromolarnym. Po uszkodzeniu zachowane były zasoby glikogenu i aktywność heksokinazy, a pomiary nie wykazały wzrostu poziomu anionorodnika ponadtlenkowego.

Mechanizm łatwiej zrozumieć przez analogię do generatora awaryjnego. Błękit metylenowy działa jako alternatywny przenośnik elektronów, który przyjmuje równoważniki redukujące i przekazuje je w kierunku cytochromu c oraz kompleksu IV. Wspiera to przepływ elektronów i syntezę ATP, jednocześnie ograniczając ucieczkę elektronów na wcześniejszych etapach łańcucha. Podczas silnego pozbawienia substratów takie pobudzenie jest niekorzystne, ponieważ zwiększa zapotrzebowanie metaboliczne, gdy tlen i glukoza są niemal nieobecne, co może szybciej wyczerpać ostatnie rezerwy. Po przywróceniu substratów ta sama właściwość staje się zaletą, ponieważ pomaga uszkodzonym mitochondriom wydajnie wykorzystać ponownie dostępny tlen i glukozę. Dlatego też wnioski z omówień mitochondrialnego transportu elektronów trzeba odnosić do kontekstu pozbawienia substratów.

Jedno zastrzeżenie: ta reguła dotycząca momentu podania odnosi się do opisanego układu doświadczalnego z astrocytami. W powiązanym badaniu komórkowym, wykorzystującym inny typ komórek, łagodniejsze pozbawienie substratów i niższe stężenie, wykazano ochronę nawet przy ekspozycji podczas tej fazy. Typ komórek, resztkowa dostępność tlenu, stężenie i protokół decydują o kierunku efektu.

Przewlekle obniżony przepływ: pamięć, oksydaza cytochromowa i naczynia w perspektywie tygodni

W eksperymentach dotyczących przewlekłego obniżenia przepływu stosowano codzienne leczenie małymi dawkami przez tygodnie, a nie pojedynczy bolus w sytuacji nagłej. W pierwszym badaniu szczury z trwałym zamknięciem tętnic szyjnych otrzymywały 4 mg/kg dziennie przez jeden miesiąc. Podanie następowało po każdej codziennej sesji treningowej, aby oddziaływać na konsolidację pamięci, a nie na doraźne wykonanie zadania. Zwierzęta z zamkniętymi tętnicami wolniej uczyły się zadań rozróżniania wzrokowego i gorzej radziły sobie w wymagającym teście pamięci, natomiast zdolność pływania, aktywność ruchowa i rozpoznawanie zapachów pozostawały bez zmian. Codzienne leczenie łagodziło deficyty uczenia się i pamięci bez zmiany ogólnego zachowania ruchowego.

W kolejnym badaniu określono aktywność oksydazy cytochromowej, czyli mitochondrialnego kompleksu IV, w 44 obszarach mózgu po takim samym miesięcznym schemacie leczenia. Zamknięcie tętnic obniżało aktywność enzymu w korze wzrokowej, przedczołowej i okołowęchowej, a także w hipokampie i ciele migdałowatym, oraz osłabiało skoordynowaną aktywność między korą wzrokową a hipokampem. Leczenie zachowywało regionalną aktywność enzymu i wzmacniało te międzyregionalne korelacje metaboliczne, a zachowana aktywność korelowała z lepszym wykonywaniem zadań. Korelacje te opisują skoordynowaną aktywność enzymu metabolicznego, a nie bezpośrednie pomiary łączności funkcjonalnej u ludzi. Przeglądy metabolizmu energetycznego mózgu pomagają zachować to rozróżnienie.

W osobnym tygodniowym badaniu stosowano 2 mg/kg dziennie i dodano inhibitor szlaku, aby zbadać mechanizm. Pod wpływem leczenia mózgowy przepływ krwi wzrósł z około 60 do około 100 mL na 100 g na minutę, a gęstość naczyń w hipokampie wzrosła z około 15.1 do 23 procent. Obie zmiany zostały częściowo odwrócone po zablokowaniu szlaku przeżycia komórkowego PI3K/Akt, a leczenie zwiększało poziom fosforylowanego Akt. Wyniki dotyczące przepływu krwi, gęstości naczyń, bariery i neuronów wskazują na ochronę neuronaczyniową związaną z sygnalizacją PI3K/Akt, a nie na efekt wyłącznie metaboliczny.

Dlaczego żadnego z tych wyników nie można utożsamiać z ratunkowym leczeniem udaru

Kontrolowane warunki laboratoryjne sprawiają, że tych wyników nie można bezpośrednio przenieść do praktyki. W hodowlach komórkowych nie ma zakrzepu ani farmakokinetyki. Model 2VO oznacza długotrwałe, globalne obniżenie przepływu, a nie nagły zator ogniskowy z penumbrą powstałą zaledwie kilka minut wcześniej. Nawet w szczurzym modelu MCAO wykorzystuje się młode, zdrowe zwierzęta, znieczulenie, jednakowe zamknięcia tętnic i precyzyjnie zaplanowane podawanie. Różni się to od sytuacji starszych pacjentów z różnymi skrzepami, miażdżycą, nadciśnieniem, cukrzycą i nieznanym czasem początku objawów.

Żadne opublikowane randomizowane badanie u ludzi nie potwierdziło błękitu metylenowego jako ratunkowego leczenia ostrego udaru niedokrwiennego. W czasem przytaczanym badaniu obrazowym u ludzi uczestniczyło 26 zdrowych dorosłych, a nie pacjenci z udarem. Pojedyncza dawka doustna zmieniła sygnały mózgowe związane z wykonywaniem zadań i przyniosła niewielką poprawę odtwarzania informacji z pamięci. Wskazuje to na działanie w ośrodkowym układzie nerwowym, a nie na skuteczność w udarze. Aktualne zalecenia dotyczące postępowania ratunkowego koncentrują się natomiast na szybkiej reperfuzji przez dożylną trombolizę u kwalifikujących się pacjentów oraz trombektomię w odpowiednich przypadkach zamknięcia dużych naczyń. Standardowe ścieżki ratunkowego leczenia udaru pozostają jedynym postępowaniem o udowodnionej skuteczności. Przy podejrzeniu udaru nigdy nie należy opóźniać pomocy w celu podania błękitu metylenowego, a praktyczne ograniczenia ekstrapolacji dawkowania z badań przedklinicznych wyjaśniają, dlaczego schematów stosowanych u szczurów nie można traktować jako schematów klinicznych.

Kwestie bezpieczeństwa dodatkowo podkreślają tę granicę. Dożylny błękit metylenowy jest objęty ostrzeżeniem w ramce dotyczącym ciężkiego lub śmiertelnego zespołu serotoninowego przy łączeniu z lekami serotoninergicznymi, w tym SSRI, SNRI i inhibitorami MAO, które przyjmuje wielu pacjentów w wieku typowym dla udaru. Jest przeciwwskazany przy niedoborze G6PD ze względu na ryzyko hemolizy. Hamuje również sygnalizację tlenku azotu, co w niektórych warunkach zwiększa opór naczyniowy i ciśnienie, dlatego nie należy opisywać go po prostu jako leku zwiększającego przepływ krwi przez mózg. Zatwierdzony schemat dożylny 1 mg/kg w nabytej methemoglobinemii nie jest schematem leczenia udaru.

Rzetelne podsumowanie jest wąskie, ale oparte na rzeczywistych wynikach. W okresie reperfuzji przy przejściowym niedokrwieniu ogniskowym małe dawki błękitu metylenowego ograniczały rozwój zmian u szczurów. Przy trwałym zamknięciu tętnicy opóźniał on powstanie zawału, ale mu nie zapobiegał. W astrocytach szkodził podczas silnego pozbawienia substratów, a pomagał przy ponownym natlenieniu. Podczas przewlekłej hipoperfuzji przez tygodnie zachowywał aktywność oksydazy cytochromowej, naczynia i pamięć. Jeden przenośnik, trzy konteksty, trzy odpowiedzi.