ପ୍ରବନ୍ଧ
DNA ଓ RNA ରଞ୍ଜନ ପାଇଁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ: ଜେଲ୍ ଓ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ରେ ପ୍ରୟୋଗ
ଜଣେ ଛାତ୍ର ଆଗାରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ଚଲାନ୍ତି, ତାହାକୁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁରେ ରଞ୍ଜିତ କରନ୍ତି, ଏବଂ ଯେଉଁଠି ଏକ ଉଜ୍ଜ୍ୱଳ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଦେଖାଯିବ ବୋଲି ଆଶା କରିଥିଲେ, ସେଠାରେ କିଛି ଦେଖନ୍ତି ନାହିଁ। ପାଖ ପରୀକ୍ଷାସ୍ଥଳରେ ଜଣେ ପୋଷ୍ଟଡକ୍ଟରାଲ୍ ଗବେଷକ ସେହି ନୀଳ ଦ୍ରବଣର ବୋତଲ ବ୍ୟବହାର କରି ଏକ ନର୍ଦର୍ନ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍କୁ ରଞ୍ଜିତ କରନ୍ତି ଏବଂ ତିନି ମିନିଟ୍ରେ ସ୍ପଷ୍ଟ ରାଇବୋସୋମାଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ପାଆନ୍ତି। ଛାତ୍ର ନିଷ୍କର୍ଷ କରନ୍ତି ଯେ ଜେଲ୍ ବିଫଳ ହୋଇଛି। ଜେଲ୍ ବିଫଳ ହୋଇନଥିଲା। ଦୁଇଟି କାମ ଭିନ୍ନ ଥିଲା, ଏବଂ ସେହି ଏକ ରଞ୍ଜକ ଭିନ୍ନ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା, ଭିନ୍ନ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ପଦକ୍ଷେପ ପାଇଁ ଭିନ୍ନ ନିୟମ ସହ ସେଗୁଡ଼ିକର ଉତ୍ତର ଦିଏ।
ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଦ୍ୱାରା DNA ରଞ୍ଜନ ଓ RNA ରଞ୍ଜନର ରସାୟନ ସମାନ, କିନ୍ତୁ ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟ ସମାନ ନୁହେଁ। ଜେଲ୍ରେ ଏହି ରଞ୍ଜକ ଏକ ରନ୍ଧ୍ରଯୁକ୍ତ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସ ଭିତରେ କେତେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଆମ୍ଲ ଅଛି ତାହା ସୂଚାଏ। ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ରେ ଏହା ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ସଫଳ ହୋଇଛି କି ନାହିଁ ଏବଂ ଲେନ୍ଗୁଡ଼ିକରେ ସମାନ ପରିମାଣର ନମୁନା ଲୋଡ୍ ହୋଇଛି କି ନାହିଁ ତାହା ସୂଚାଏ। ଏହି ପାର୍ଥକ୍ୟ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୋଇଗଲେ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍, ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ଏବଂ ସୁସଙ୍ଗତତାର ସୀମା ବୁଝିବା ସହଜ ହୁଏ।
ସଂକ୍ଷିପ୍ତ ଉତ୍ତର
ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଏକ ସମତଳ ଧନାୟନିକ ରଞ୍ଜକ, ଯାହା ଫସ୍ଫେଟ୍ ପ୍ରତି ସ୍ଥିରବିଦ୍ୟୁତୀୟ ଆକର୍ଷଣ, ବେସ୍ ଯୁଗଳ ମଧ୍ୟରେ ଇଣ୍ଟରକାଲେସନ୍ ଏବଂ କ୍ଷୁଦ୍ର ଖାଜ ସହ ସଂଯୋଗର ମିଶ୍ରଣ ମାଧ୍ୟମରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଆମ୍ଲ ସହ ଅସହସଂଯୋଜୀ ଓ ପ୍ରତ୍ୟାବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ଭାବେ ବନ୍ଧିତ ହୁଏ। ଏହି ପ୍ରତ୍ୟାବର୍ତ୍ତନଶୀଳତା ହିଁ ମୁଖ୍ୟ କଥା। ବ୍ୟାଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକୁ ରଞ୍ଜିତ କରି ଦୃଶ୍ୟମାନ ଆଲୋକରେ ଦେଖାଯାଇପାରେ, ସେଗୁଡ଼ିକର ଛବି ରଖାଯାଇପାରେ, ଏବଂ ପରେ କ୍ଲୋନିଂ, ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍ କିମ୍ବା ପୁନଃ ପ୍ରୋବ୍ ପ୍ରୟୋଗ ପାଇଁ ରଞ୍ଜକ ହଟାଯାଇପାରେ କିମ୍ବା ନମୁନା ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇପାରେ।
ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ DNA ପାଇଁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଆଗାରୋଜ୍ ଜେଲ୍ ରଞ୍ଜନର ମାନକ ଦ୍ରୁତ ପ୍ରଣାଳୀ ହେଉଛି ପାଣିରେ 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL), ପ୍ରାୟ 15 ମିନିଟ୍ ରଞ୍ଜନ ଏବଂ ତା’ପରେ ପାଣିରେ ପ୍ରାୟ 15 ମିନିଟ୍ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା, ଏବଂ ଧଳା ଆଲୋକ ବକ୍ସରେ ଦେଖିବା। ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପାଇଁ ପାରମ୍ପରିକ ନର୍ଦର୍ନ ବ୍ଲଟ୍ ପ୍ରଣାଳୀରେ ପ୍ରାୟ pH 5.2 ଥିବା ସୋଡିୟମ୍ ଆସିଟେଟ୍ରେ 0.02 ରୁ 0.04 percent ରଞ୍ଜକ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ; ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ଓ ସ୍ଥିରୀକରଣ ପରେ କିଛି ମିନିଟ୍ ରଞ୍ଜନ କରାଯାଏ, ତା’ପରେ ପାଣିରେ ଧୋଇ ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍ ପୂର୍ବରୁ ରଞ୍ଜକ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ହଟାଯାଏ। ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ସୀମିତ: ଭଲ ପରିସ୍ଥିତିରେ ପ୍ରତି ଜେଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ପାଇଁ ଦଶକରୁ ଶତକ nanograms, ଏବଂ ସତର୍କ ଆକଳନ ଦେଉଥିବା ନିର୍ଦ୍ଦେଶିକାଗୁଡ଼ିକରେ 0.5 ରୁ 1 microgram ଉଲ୍ଲେଖ ଅଛି। ଏହା ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ ଓ SYBR ରଞ୍ଜକର ଚିହ୍ନଟ ସୀମାଠାରୁ ଅନେକ ଗୁଣ ଅଧିକ। ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ରେ ଏକକ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟ ପାଇଁ କୌଣସି ଉପଯୋଗୀ ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ନାହିଁ, କାରଣ ଏହି ରଞ୍ଜକ ମୁଖ୍ୟତଃ ପ୍ରଚୁର ପରିମାଣରେ ଥିବା ରାଇବୋସୋମାଲ୍ RNA ଓ ମୋଟ ଲୋଡ୍ ହୋଇଥିବା ପଦାର୍ଥକୁ ଦେଖାଏ। କୌଣସି ପ୍ରଣାଳୀରେ ଖୁଚୁରା ବଜାରର ସପ୍ଲିମେଣ୍ଟ ଦ୍ରବଣକୁ ବିକଳ୍ପ ଭାବେ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ନାହିଁ। ବୈଧତା ପରୀକ୍ଷିତ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ବିଶ୍ଳେଷଣାତ୍ମକ ମାନର ରଞ୍ଜକ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ବଫର୍ ଏବଂ RNA ଥିଲେ RNase-ମୁକ୍ତ ପରିଚାଳନା ଉପରେ ଆଧାରିତ।
ବନ୍ଧନ କିପରି କାମ କରେ, ଏବଂ କେଉଁଠି ଭ୍ରମ ସୃଷ୍ଟି କରେ
ଏହି ପ୍ରକ୍ରିୟା ବୁଝିବା ପାଇଁ ଉପଯୋଗୀ ମଡେଲ୍ର ତିନୋଟି ଭାଗ ଅଛି। ପ୍ରଥମେ, ଧନାତ୍ମକ ଆବେଶଯୁକ୍ତ ରିଙ୍ଗ୍ ପ୍ରଣାଳୀ ଋଣାତ୍ମକ ଆବେଶଯୁକ୍ତ ଫସ୍ଫେଟ୍ ମେରୁଦଣ୍ଡ ପ୍ରତି ଆକର୍ଷିତ ହୁଏ। ବର୍ଣ୍ଣାଳୀବିଜ୍ଞାନ ଗବେଷଣାରେ କମ୍ ଲବଣ ଥିବାବେଳେ ଏହି ସ୍ଥିରବିଦ୍ୟୁତୀୟ ଅଂଶ ପ୍ରଧାନ ବୋଲି ଦେଖାଯାଏ, ଯେତେବେଳେ ମଡେଲିଂ ଓ ଆଣବିକ ଗତିବିଜ୍ଞାନ ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ DNA ପାଇଁ ଇଣ୍ଟରକାଲେସନ୍ ଓ କ୍ଷୁଦ୍ର ଖାଜରେ ବନ୍ଧନକୁ ସ୍ଥିର ବନ୍ଧନ ପ୍ରକାର ଭାବେ ଦର୍ଶାଏ; ଏହା ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ–DNA ବନ୍ଧନର ଏକ ବର୍ଣ୍ଣାଳୀବିଜ୍ଞାନ ଅଧ୍ୟୟନରେ ସାରାଂଶ କରାଯାଇଛି। ଦ୍ୱିତୀୟତଃ, GC ପ୍ରତି କିଛି ଅଗ୍ରାଧିକାର ରହିଛି: ମଡେଲିଂ CpG ଓ GpC କ୍ରମିକ ବେସ୍ ଯୁଗଳକୁ ଅଗ୍ରାଧିକାର ଦିଏ, ଏବଂ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁର ଇଣ୍ଟରକାଲେସନ୍ ଅଗ୍ରାଧିକାର ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଗବେଷଣାରେ ପରୀକ୍ଷାଗୁଡ଼ିକ GC-ସମୃଦ୍ଧ ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ ଗଠନ ସହ ଅଧିକ ସଂଯୋଗ ଦର୍ଶାଇଛି, କିନ୍ତୁ AT ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ ଗଠନ ମଧ୍ୟ ବନ୍ଧିତ ହୁଏ। ନିୟମିତ ରଞ୍ଜନ ଅନୁକ୍ରମ-ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନୁହେଁ। ତୃତୀୟତଃ, ଏକସୂତ୍ରୀ DNA ଓ RNA ମୁଖ୍ୟତଃ ସ୍ଥିରବିଦ୍ୟୁତୀୟ ଆକର୍ଷଣ ଏବଂ ଉପଲବ୍ଧ ବେସ୍ ଓ ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ ଅଞ୍ଚଳ ସହ ଷ୍ଟାକିଂ ମାଧ୍ୟମରେ ବନ୍ଧିତ ହୁଏ; ଏହି କାରଣରୁ ରଞ୍ଜନର ତୀବ୍ରତା ଦୈର୍ଘ୍ୟ, ଅନୁକ୍ରମ ଓ ଦ୍ୱିତୀୟକ ଗଠନ ଅନୁସାରେ ବଦଳେ।
ଏଥିରୁ ଦୁଇଟି ପରିଣାମ ମିଳେ। ବନ୍ଧନ ଅସହସଂଯୋଜୀ ହୋଇଥିବାରୁ ଧୋଇବା ସହ ରଞ୍ଜକ ବାହାରିଯାଏ। ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟମୂଳକ ଭାବେ ଫିକ୍ସ ନକଲେ ପଲିଆକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଶୀଘ୍ର ଫିକା ହୋଇଯାଏ। ସାଧାରଣ ରଞ୍ଜନ ଅସ୍ଥାୟୀ ହୋଇଥିବାରୁ ହିଁ ଏକ ସ୍ୱତନ୍ତ୍ର ସ୍ଥାୟୀ ଫିକ୍ସେସନ୍ ପଦ୍ଧତି ରହିଛି, ଯାହା PAGE ଜେଲ୍ ପାଇଁ Soto ଓ Draperଙ୍କ ବର୍ଣ୍ଣନାରେ ଦିଆଯାଇଛି। ଏହି ରଞ୍ଜକ ଏକ ଆଲୋକ-ସଂବେଦକ ହୋଇଥିବାରୁ ଅକ୍ସିଜେନ୍ ଉପସ୍ଥିତିରେ ରଞ୍ଜିତ DNA ଉପରେ ଦୀର୍ଘ ସମୟ ତୀବ୍ର ଆଲୋକ ପଡ଼ିଲେ ଗୁଆନିନ୍ର ଅକ୍ସିକରଣ ହୋଇପାରେ ଏବଂ ଶେଷରେ ସୂତ୍ରରେ କଟା ସୃଷ୍ଟି ହୋଇପାରେ; ଏହି କ୍ରିୟାବିଧି ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଦ୍ୱାରା ସଂବେଦିତ ଗୁଆନିନ୍ ଅକ୍ସିକରଣ ସମ୍ବନ୍ଧୀୟ ଗବେଷଣାରେ ବିସ୍ତୃତ ଭାବେ ଦିଆଯାଇଛି। ଅଳ୍ପ ସମୟ ଧଳା ଆଲୋକରେ ଦେଖିବା ଦ୍ୱାରା ପାରମ୍ପରିକ ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରବାହର ଜଣାଶୁଣା UV କ୍ଷତିକୁ ଏଡ଼ାଯାଏ, ଏବଂ ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ନମୁନା ଉଦ୍ଧାର କରିବାବେଳେ ଏହି ସୁବିଧା ବାସ୍ତବ ଅଟେ। ଦୃଶ୍ୟମାନ ଆଲୋକ କମ୍ କ୍ଷତିକାରକ, କିନ୍ତୁ ସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ନିରାପଦ ନୁହେଁ। DNA କ୍ଲୋନ୍ କରାଯିବାର ଥିଲେ ଆଲୋକ ସଂସ୍ପର୍ଶର ସମୟ କମ୍ ରଖନ୍ତୁ। ଏହି ସତର୍କତା ପଛରେ ଥିବା ବ୍ୟାପକ ଆଲୋକରସାୟନ ପାଇଁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଆଲୋକରସାୟନର ଦୁଇଟି ପଥ ଦେଖନ୍ତୁ। ଅକ୍ସିକୃତ ରୂପ କାହିଁକି ବନ୍ଧିତ ହୁଏ ଏବଂ ବିଜାରିତ ରୂପ କାହିଁକି ହୁଏ ନାହିଁ ତାହା ବୁଝାଉଥିବା ରେଡକ୍ସ ଯୁଗଳ ଓ ଆବେଶ ଅବସ୍ଥା ପାଇଁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁର ଗଠନ ଓ ଗୁଣଧର୍ମର ରସାୟନ ଦେଖନ୍ତୁ।
ପ୍ରଥମ କାମ: ଜେଲ୍ ଭିତରେ ରଞ୍ଜନ
ଜେଲ୍ ରଞ୍ଜନ ଗୋଟିଏ ପ୍ରଶ୍ନର ଉତ୍ତର ଦିଏ: ଏହି ବ୍ୟାଣ୍ଡରେ ଖାଲି ଆଖିରେ ଦେଖିବା ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଆମ୍ଲ ଅଛି କି? ଆଗାରୋଜ୍ରେ ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ DNA ହେଉଛି ସବୁଠାରୁ ଭଲ ଭାବେ ଅଧ୍ୟୟନ କରାଯାଇଥିବା ପ୍ରୟୋଗ। Flores ଓ ସହକର୍ମୀଙ୍କ ମୂଳ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଜେଲ୍ ପଦ୍ଧତି 1 percent ଆଗାରୋଜ୍ରେ 0.02 percent ଦ୍ରୁତ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ର ବୈଧତା ପରୀକ୍ଷା କରିଥିଲା ଏବଂ ପରେ ସଫଳ ଉଦ୍ଧାର ଓ କ୍ଲୋନିଂ ଦର୍ଶାଇଥିଲା। ସେହି ଯୋଗାଣକାରୀ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ IBI Scientificର ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଉତ୍ପାଦ ପୃଷ୍ଠାରେ ମଧ୍ୟ ଦିଆଯାଇଛି, ଯେଉଁଠି 0.04 percent ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ପ୍ରଣାଳୀ ଓ ଦ୍ରୁତ ଜେଲ୍ ପଦ୍ଧତି ପାଖାପାଖି ତାଲିକାଭୁକ୍ତ ଅଛି।
ବ୍ୟବହାରିକ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରବାହ:
- ଜେଲ୍କୁ ସାଧାରଣ ଭାବେ ଚଲାନ୍ତୁ। ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଫୋରେସିସ୍ ପରେ ରଞ୍ଜନ କରନ୍ତୁ, ଚାଲିଥିବା ସମୟରେ ନୁହେଁ; କେବଳ ସଂଶୋଧିତ ପଦ୍ଧତି ପାଇଁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ କିମ୍ବା ବିଭେଦନ କ୍ଷମତାର ବୈଧତା ପରୀକ୍ଷା ହୋଇଥିଲେ ଏହାର ବ୍ୟତିକ୍ରମ କରନ୍ତୁ।
- ଆସୁତ ଜଳରେ ପ୍ରସ୍ତୁତ 0.02 percent w/v ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁରେ ବୁଡ଼ାଇ ହାଲୁକା ହଲାଇ ପ୍ରାୟ 15 ମିନିଟ୍ ରଖନ୍ତୁ।
- ମୋଟ ପ୍ରାୟ 15 ମିନିଟ୍ ଧରି ଅନେକ ଥର ପାଣି ବଦଳାଇ ରଞ୍ଜକ ହଟାନ୍ତୁ, ଯେପର୍ଯ୍ୟନ୍ତ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସର ପୃଷ୍ଠଭୂମି ରଙ୍ଗ କମେ ଓ ବ୍ୟାଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ସ୍ପଷ୍ଟ ଦେଖାଯାଏ।
- ଧଳା ଆଲୋକ ଇଲ୍ୟୁମିନେଟର୍ରେ ତୁରନ୍ତ ଫଟୋ ନିଅନ୍ତୁ।
ଆଗାରୋଜ୍ ଓ ପଲିଆକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ଭିନ୍ନ ଭାବେ ବ୍ୟବହାର କରେ। ଆଗାରୋଜ୍ ମ୍ୟାଟ୍ରିକ୍ସରେ ରଞ୍ଜକ ଧରି ରଖେ, ତେଣୁ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା ଧୀର ପଦକ୍ଷେପ ହୁଏ। ପତଳା ପଲିଆକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ ଜେଲ୍ ଶୀଘ୍ର ରଞ୍ଜିତ ହୁଏ, କିନ୍ତୁ ଶୀଘ୍ର ରଞ୍ଜକ ହରାଏ ମଧ୍ୟ; ଏହା ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ବ୍ୟାଣ୍ଡ କାଟି ବାହାର କରିବାରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ, କିନ୍ତୁ ଦୀର୍ଘକାଳୀନ ରେକର୍ଡ ରଖିବାରେ ଅସୁବିଧା କରେ। ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ Current Protocols ଶୈଳୀର PAGE ପଦ୍ଧତି ଅନୁସରଣ କରି, ବାରମ୍ବାର ପାଣିରେ ଧୋଇବା ସହ ସେହି 0.02 percent ପ୍ରଣାଳୀରେ 20 ରୁ 30 ମିନିଟ୍ରେ ପଲିଆକ୍ରିଲାମାଇଡ୍ରେ ଥିବା କୃତ୍ରିମ ଅଲିଗୋନ୍ୟୁକ୍ଲିଓଟାଇଡ୍ର ଅବସ୍ଥାନ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇପାରେ। ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ଅଲିଗୋ ପ୍ରସ୍ତୁତିରେ ପତଳା TBE ଭିତରେ ପ୍ରାୟ 0.0002 percent ଥିବା ଅତ୍ୟନ୍ତ ପତଳା ଦ୍ରବଣକୁ କେତେକ ଘଣ୍ଟା ବ୍ୟବହାର କରିବାର ପଦ୍ଧତି ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଛି, କିନ୍ତୁ ଏହାର ପ୍ରମାଣଭିତ୍ତି ଦୁର୍ବଳ।
DNA ଓ RNA ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ଗୁରୁତ୍ୱପୂର୍ଣ୍ଣ। ଦ୍ୱିସୂତ୍ରୀ DNA ସବୁଠାରୁ ଶକ୍ତିଶାଳୀ ଗଠନଭିତ୍ତିକ ବନ୍ଧନ ଦିଏ। RNA ଓ ଏକସୂତ୍ରୀ DNA ରଞ୍ଜିତ ହୁଏ, କିନ୍ତୁ ଦୁର୍ବଳ ଭାବେ ଏବଂ କମ୍ ପୂର୍ବାନୁମାନଯୋଗ୍ୟ ଭାବେ। ଫର୍ମାଲ୍ଡିହାଇଡ୍ ଆଗାରୋଜ୍ RNA ଜେଲ୍ ପାଇଁ ଅଧିକାଂଶ ପରୀକ୍ଷାଗାର ଜେଲ୍ ଭିତରେ ନୀଳ ରଞ୍ଜନ ନକରି ପ୍ରଥମେ RNAକୁ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତି, ତା’ପରେ ସେଠାରେ ରଞ୍ଜନ କରନ୍ତି। ଏହି ପରିବର୍ତ୍ତନ ଦୁର୍ବଳ ଜେଲ୍ ସଙ୍କେତ ବଦଳରେ ଅଧିକ ସ୍ପଷ୍ଟ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସଙ୍କେତ ସହ ଲୋଡିଂର ଏକ ରେକର୍ଡ ଦିଏ।
ଦ୍ୱିତୀୟ କାମ: ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ରେ ରଞ୍ଜନ
ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ରଞ୍ଜନ ଏକ ଭିନ୍ନ ପ୍ରଶ୍ନର ଉତ୍ତର ଦିଏ: ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ସଫଳ ହୋଇଛି କି, ଏବଂ ଲେନ୍ଗୁଡ଼ିକ ତୁଳନାଯୋଗ୍ୟ କି? ପାରମ୍ପରିକ ପ୍ରୟୋଗ ହେଉଛି Herrin ଓ Schmidtଙ୍କ ପ୍ରତ୍ୟାବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ନର୍ଦର୍ନ ବ୍ଲଟ୍ ରଞ୍ଜନ; ମୂଳ ପଦ୍ଧତିରେ pH 5.0ରେ 50 mM ସୋଡିୟମ୍ ଆସିଟେଟ୍ରେ 0.04 percent ରଞ୍ଜକ ସହ 2 ରୁ 3 ମିନିଟ୍ ରଞ୍ଜନ କରି ପାଣିରେ ଧୋଇବା, ଏବଂ ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍ ପୂର୍ବରୁ SSPEରେ ପତଳା SDS ଦ୍ୱାରା ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ ଥିଲା।
ବହୁଳ ବ୍ୟବହୃତ ଆଧୁନିକ ପଦ୍ଧତି ନିମ୍ନପ୍ରକାର:
- RNA କିମ୍ବା ବିକୃତୀକୃତ DNAକୁ ନାଇଲନ୍ କିମ୍ବା ନାଇଟ୍ରୋସେଲୁଲୋଜ୍କୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତର କରନ୍ତୁ, ତା’ପରେ UV କ୍ରସ୍ଲିଙ୍କିଂ କିମ୍ବା ବେକିଂ ଦ୍ୱାରା ସ୍ଥିର କରନ୍ତୁ, ଯାହାଫଳରେ ରଞ୍ଜନ ସମୟରେ ନମୁନା ହରାଇ ନଯାଏ।
- ଇଚ୍ଛାଧୀନ କିନ୍ତୁ ସାଧାରଣତଃ କରାଯାଉଥିବା ପଦକ୍ଷେପ: ମେମ୍ବ୍ରେନ୍କୁ 5 percent ଆସିଟିକ୍ ଆମ୍ଲରେ ପ୍ରାୟ 15 ମିନିଟ୍ ଭିଜାନ୍ତୁ।
- ପ୍ରାୟ pH 5.2ରେ 0.3 ରୁ 0.5 M ସୋଡିୟମ୍ ଆସିଟେଟ୍ରେ ଥିବା 0.02 ରୁ 0.04 percent ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁରେ 5 ରୁ 10 ମିନିଟ୍ ରଞ୍ଜନ କରନ୍ତୁ।
- ଧୋଇ ପାଣିରେ 5 ରୁ 15 ମିନିଟ୍ ରଞ୍ଜକ ହଟାନ୍ତୁ, ଛବି ରଖନ୍ତୁ, ତା’ପରେ ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍ ପୂର୍ବରୁ ଅବଶିଷ୍ଟ ରଞ୍ଜକ ହଟାନ୍ତୁ।
ନର୍ଦର୍ନ କାମରେ ଧନାତ୍ମକ ଆବେଶଯୁକ୍ତ ନାଇଲନ୍ ସବୁଠାରୁ ଅଧିକ ବ୍ୟବହୃତ ହୁଏ। ସେହି ଆସିଟିକ୍ ଆମ୍ଲ ଓ ଆସିଟେଟ୍ କାର୍ଯ୍ୟପ୍ରବାହରେ ନାଇଟ୍ରୋସେଲୁଲୋଜ୍ ମଧ୍ୟ କାମ କରେ। ଛବିକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ନିଶ୍ଚିତ କରିବା, 28S ଓ 18S ବ୍ୟାଣ୍ଡ ତୁଳନା କରିବା (କିମ୍ବା ବ୍ୟାକ୍ଟେରିଆ RNA ପାଇଁ 23S ଓ 16S), ଲ୍ୟାଡର୍ ଓ ମାନକ ଚିହ୍ନିତ କରିବା, ଏବଂ ମୋଟ RNA ସାମାନ୍ୟୀକରଣର ଏକ ଆନୁମାନିକ ରେକର୍ଡ ରଖିବା ପାଇଁ ବ୍ୟବହାର କରାଯାଏ। ପ୍ରକାଶିତ ନର୍ଦର୍ନ ପଦ୍ଧତିଗୁଡ଼ିକ ଲୋଡିଂ ଯାଞ୍ଚ ପାଇଁ ରଞ୍ଜିତ ରାଇବୋସୋମାଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡର ପରିମାଣ ମାପନ୍ତି; ଏଥିରେ ସାମାନ୍ୟୀକରଣ ପାଇଁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ରାଇବୋସୋମାଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ବ୍ୟବହାର କରିଥିବା ଦୁଗ୍ଧ ବିଜ୍ଞାନ ଗବେଷଣା ମଧ୍ୟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। ସଦର୍ନ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍କୁ ମଧ୍ୟ ସେହିପରି ଦେଖାଯାଇପାରେ, କିନ୍ତୁ ଏହି ରଞ୍ଜକ ନର୍ଦର୍ନ ଲୋଡିଂ ଓ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ଯାଞ୍ଚ ପାଇଁ ଅଧିକ ପ୍ରତିଷ୍ଠିତ। ସଦର୍ନ DNAକୁ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ପୂର୍ବରୁ ବିକୃତୀକୃତ କରାଯାଏ, ତେଣୁ ଜେଲ୍ର ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ଆକଳନ ସେଠାରେ ସିଧାସଳଖ ଲାଗୁ ହୁଏ ନାହିଁ।
ଚିହ୍ନଟ ସୀମା ଓ ପୃଷ୍ଠଭୂମି: ଯେଉଁଠି ନୀଳ ରଞ୍ଜକ ପଛରେ ପଡ଼େ
ନିମ୍ନ ତୁଳନା ଉଦ୍ଦେଶ୍ୟମୂଳକ ଭାବେ ଆନୁମାନିକ। ରଞ୍ଜକର କାର୍ଯ୍ୟଦକ୍ଷତା ଜେଲ୍ର ପ୍ରତିଶତ, ବ୍ୟାଣ୍ଡର ପ୍ରସ୍ଥ, ଆଲୋକୀୟ ବ୍ୟବସ୍ଥା ଏବଂ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବାର ନିୟମିତତା ଉପରେ ନିର୍ଭର କରେ। ପ୍ରତ୍ୟେକ ସଂଖ୍ୟାକୁ ପରିମାଣର ଏକ ଆନୁମାନିକ ସ୍ତର ଭାବେ ନିଅନ୍ତୁ, ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାନ ଭାବେ ନୁହେଁ।
| ରଞ୍ଜକ ଓ ପ୍ରୟୋଗ ରୂପ | ପ୍ରତି ବ୍ୟାଣ୍ଡରେ ଆନୁମାନିକ ଚିହ୍ନଟ ପରିମାଣ | ବ୍ୟାଖ୍ୟା |
|---|---|---|
| ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ, ଆଗାରୋଜ୍ରେ dsDNA | ଅନୁକୂଳିତ ପରିସ୍ଥିତିରେ 40 ରୁ 250 ng; ସତର୍କ ଆକଳନରେ 0.5 ରୁ 1 microgram | ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ଅଧିକ ପରିମାଣର ନମୁନା ଓ ଶିକ୍ଷାଦାନ ଜେଲ୍ ପାଇଁ ଯଥେଷ୍ଟ। ଅତ୍ୟଳ୍ପ ପରିମାଣର ବ୍ୟାଣ୍ଡ ପାଇଁ ଦୁର୍ବଳ। |
| ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ, PAGEରେ ଛୋଟ ssDNA କିମ୍ବା RNA କିମ୍ବା ଅଲିଗୋ | ପ୍ରାୟ 0.1 ରୁ 0.5 microgram | ଦୈର୍ଘ୍ୟ ଓ ଗଠନ ଉପରେ ନିର୍ଭରଶୀଳ। କୌଣସି ସାର୍ବଜନୀନ ସୀମା ନାହିଁ। |
| ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍, ଆଗାରୋଜ୍ରେ dsDNA | ପ୍ରାୟ 1 ରୁ 10 ng | Floresଙ୍କ ତୁଳନାରେ ଅନୁକୂଳିତ ନୀଳ ରଞ୍ଜକଠାରୁ ପ୍ରାୟ ଚାରିଗୁଣ ଅଧିକ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ। UV ଆବଶ୍ୟକ। |
| SYBR Green I, dsDNA | ପ୍ରାୟ 60 pg | ଫ୍ଲୁଓରେସେନ୍ସ ଇମେଜିଂ ଆବଶ୍ୟକ। |
| SYBR Gold, DNA ଓ RNA | ପ୍ରାୟ 25 pg | ବିଭିନ୍ନ ପ୍ରୟୋଗ ରୂପରେ ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ଠାରୁ ଦଶଗୁଣରୁ ଅଧିକ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ। |
| ସିଲଭର୍ ରଞ୍ଜନ, PAGEରେ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଆମ୍ଲ | ପ୍ରାୟ 0.3 ରୁ 0.9 ng; ଅନୁକୂଳିତ ନୀଳ ରଞ୍ଜନ ପରେ ସିଲଭର୍ ରଞ୍ଜନ କ୍ରମରେ 100 pg RNA ଚିହ୍ନଟ ହେବା ପ୍ରକାଶିତ ହୋଇଛି | ଅତ୍ୟନ୍ତ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ, କିନ୍ତୁ ରାସାୟନିକ ପ୍ରକ୍ରିୟା ଜଟିଳ ଓ ନମୁନା ଉଦ୍ଧାର ପାଇଁ ଅନୁପଯୁକ୍ତ। |
| ଟୋଲୁଇଡିନ୍ ବ୍ଲୁ, PAGEରେ RNA ଓ ଅଲିଗୋ | ବ୍ୟବହାରିକ ପରିମାଣ ଶତକ ng ସ୍ତରରେ, ପ୍ରାୟ 250 ng ଲିପିବଦ୍ଧ | ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ପରି ଦୃଶ୍ୟମାନ ଆଲୋକରେ ଦେଖାଯାଏ, କିନ୍ତୁ SYBRର ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ମାନ ସହ ତୁଳନାଯୋଗ୍ୟ କୌଣସି ମାନକୀକୃତ ସୀମା ନାହିଁ। |
ପୃଷ୍ଠଭୂମି ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ହିଁ ନିର୍ଦ୍ଧାରଣ କରେ ଯେ ସୀମିତ ସଙ୍କେତଟି ବ୍ୟବହାରଯୋଗ୍ୟ କି ନୁହେଁ। ମୁକ୍ତ ରଞ୍ଜକର ରଙ୍ଗ ଅତ୍ୟନ୍ତ ତୀବ୍ର, ତେଣୁ ବନ୍ଧିତ ରଞ୍ଜକକୁ ନହଟାଇ ଅବନ୍ଧିତ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇଲେ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଓ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ମଧ୍ୟରେ ପାର୍ଥକ୍ୟ ସ୍ପଷ୍ଟ ହୁଏ। ଅଧିକ ଘନତାର ରଞ୍ଜକ କ୍ୱଚିତ୍ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା ବଢ଼ାଏ। ଏହା ମୁଖ୍ୟତଃ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବାର ସମୟ ବଢ଼ାଏ। ଆପଣ ବ୍ୟବହାର କରୁଥିବା ସେହି ଜେଲ୍, ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ଓ କ୍ୟାମେରାରେ କ୍ରମିକ ତନୁକରଣର ଏକ ଶୃଙ୍ଖଳା ପରୀକ୍ଷା କରନ୍ତୁ, ଏବଂ କେବଳ ସେହି ପରିସର ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ ଯେଉଁଠି ସମନ୍ୱିତ ଘନତା ନମୁନାର ପରିମାଣ ସହ ସମାନୁପାତିକ ରହେ। ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ଅର୍ଦ୍ଧ-ପରିମାଣାତ୍ମକ ଲୋଡିଂ ସାମାନ୍ୟୀକରଣରେ ସାହାଯ୍ୟ କରେ। ଏହା ଉଚ୍ଚ ଡାଇନାମିକ୍ ରେଞ୍ଜ ଥିବା ପରିମାଣାତ୍ମକ ପରୀକ୍ଷା ନୁହେଁ, କାରଣ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ର ଧାରଣକ୍ଷମତା, ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ଦକ୍ଷତା, ସନ୍ତୃପ୍ତି ଏବଂ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବାର ମାତ୍ରା ଲେନ୍ରୁ ଲେନ୍କୁ ବଦଳେ।
ସୁସଙ୍ଗତତାର ସୀମା: ରଞ୍ଜନ ପରେ କ’ଣ ବ୍ୟବହାରଯୋଗ୍ୟ ରହେ
ନୀଳ ରଞ୍ଜନ ପରେ କ୍ଲୋନିଂ ସଫଳ ହେବା ପ୍ରଦର୍ଶିତ ହୋଇଛି। Flores ଓ ସହକର୍ମୀମାନେ ରଞ୍ଜିତ ଆଗାରୋଜ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ କାଟି ବାହାର କରିଥିଲେ, DNA ଉଦ୍ଧାର କରିଥିଲେ, ଏବଂ ତାହାର ଲିଗେସନ୍ ଓ ଟ୍ରାନ୍ସଫର୍ମେସନ୍ କରିଥିଲେ। ସେମାନେ UV ସହ ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ ବ୍ୟବହାର ପରବର୍ତ୍ତୀ କ୍ଲୋନିଂଠାରୁ ଭଲ ଫଳ ମିଳିବା ଦର୍ଶାଇଥିଲେ। ସମ୍ଭାବ୍ୟ କାରଣ ହେଉଛି କମ୍ ଆଲୋକଜନିତ କ୍ଷତି, ରଞ୍ଜକ ନିଜେ କୌଣସି ଲାଭ ଦେବା ନୁହେଁ। ଧଳା ଆଲୋକର ସଂସ୍ପର୍ଶ ଅଳ୍ପ ସମୟ ପାଇଁ ରଖନ୍ତୁ ଏବଂ ଉଦ୍ଧାର କରାଯାଇଥିବା DNAକୁ ସାଧାରଣ ଜେଲ୍ ଏକ୍ସଟ୍ରାକ୍ସନ୍ ଶୁଦ୍ଧୀକରଣ ପ୍ରକ୍ରିୟାରେ ପରିଷ୍କାର କରନ୍ତୁ।
PCR ଓ ସିକ୍ୱେନ୍ସିଂ ପାଇଁ ପ୍ରମାଣ କମ୍। ଅବଶିଷ୍ଟ ରଞ୍ଜକ ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଆମ୍ଲ ସହ ବନ୍ଧିତ ହୁଏ, ତେଣୁ ଏନ୍ଜାଇମ୍-ଭିତ୍ତିକ ପଦକ୍ଷେପ ପୂର୍ବରୁ ରଞ୍ଜକ ହଟାନ୍ତୁ ଓ ନମୁନା ଶୁଦ୍ଧ କରନ୍ତୁ। ନୀଳ ରଞ୍ଜିତ ଜେଲ୍ରୁ ସଠିକ୍ ଭାବେ ଶୁଦ୍ଧ କରାଯାଇଥିବା DNA କାମ କରିବା ଆଶା କରାଯାଏ, କିନ୍ତୁ ବିଭିନ୍ନ ପଲିମେରେଜ୍ ଓ ସିକ୍ୱେନ୍ସିଂ ରସାୟନରେ ସିଧାସଳଖ ରହିଯାଇଥିବା ରଞ୍ଜକ ପ୍ରତି ସହନଶୀଳତା ଭଲ ଭାବେ ମାପାଯାଇନାହିଁ। ଏହାକୁ ଧରିନିଅନ୍ତୁ ନାହିଁ।
କ୍ରମ କଠୋର ଭାବେ ମାନିଲେ ବ୍ଲଟ୍ ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍ ସୁସଙ୍ଗତ ହୁଏ: ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ, ସ୍ଥିରୀକରଣ, ରଞ୍ଜନ, ଛବି ରଖିବା, ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା, ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍। ଏହି କ୍ରମ ହେଉଛି Herrin ଓ Schmidtଙ୍କ ପଦ୍ଧତି। ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ପୂର୍ବରୁ ରଞ୍ଜନ କରିବା କିମ୍ବା ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବାକୁ ଛାଡ଼ିଦେବା ଏକ ଭିନ୍ନ ପଦ୍ଧତି, ଯାହାର ନିଜସ୍ୱ ବୈଧତା ପରୀକ୍ଷା ଆବଶ୍ୟକ। ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା ପରେ ମାନକ ପ୍ରୋବ୍ ଅପସାରଣ ଓ ପୁନଃ ପ୍ରୋବ୍ ପ୍ରୟୋଗ ସାଧାରଣ ଭାବେ କରାଯାଇପାରେ। ସେହି ରଞ୍ଜକ ପରିବାର ସହ କୋଷ ସ୍ତରରେ ରଞ୍ଜନ ଏବଂ ଫିକ୍ସ କରାଯାଇଥିବା ଫିଲ୍ମର ତର୍କ କାହିଁକି ଜୀବନ୍ତ କୋଷ ପଦ୍ଧତିରେ ଲାଗୁ ହୁଏ ନାହିଁ ଜାଣିବା ପାଇଁ ମାଇକ୍ରୋସ୍କୋପି ରଞ୍ଜନ ଆଟଲାସ୍ ଦେଖନ୍ତୁ।
ପରବର୍ତ୍ତୀ ବ୍ୟବହାର ପାଇଁ ଆଗାରୋଜ୍ରୁ ଏବଂ ନୀଳ ରଞ୍ଜକରେ ଚିହ୍ନଟ କରାଯାଇଥିବା PAGE ଅଲିଗୋରୁ ବ୍ୟାଣ୍ଡ କାଟି ବାହାର କରିବା କାମ କରେ, ଯଦି ସ୍ଥାୟୀ ଫିକ୍ସେସନ୍ ପଦ୍ଧତିକୁ ଏଡ଼ାଯାଏ। ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା ପରେ ଇଲେକ୍ଟ୍ରୋଇଲ୍ୟୁସନ୍ କରିବା ଏକ ପ୍ରତ୍ୟାବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ବନ୍ଧକ ପାଇଁ ରାସାୟନିକ ଭାବେ ସମ୍ଭବ, କିନ୍ତୁ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ ପାଇଁ ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ନିୟନ୍ତ୍ରିତ ଉଦ୍ଧାର ପରିମାଣର ତଥ୍ୟ ଅଳ୍ପ। ଇଲ୍ୟୁସନ୍ ପରେ ଲବଣ ହଟାନ୍ତୁ କିମ୍ବା ଅବକ୍ଷେପଣ କରନ୍ତୁ।
ବାରମ୍ବାର ଘଟୁଥିବା ବିଫଳତା
ଫିକା ଜେଲ୍ ବ୍ୟାଣ୍ଡ ସାଧାରଣତଃ ସୂଚାଏ ଯେ ବର୍ଣ୍ଣମିତିକ ରଞ୍ଜକ ପାଇଁ ପଦାର୍ଥର ପରିମାଣ ଅତ୍ୟଳ୍ପ, ବିଶେଷତଃ ଛୋଟ ଏକସୂତ୍ରୀ କିମ୍ବା RNA ଲକ୍ଷ୍ୟ ପାଇଁ। ଅଧିକ ନମୁନା ଲୋଡ୍ କରନ୍ତୁ, ନୂଆ ରଞ୍ଜକ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ଘନତା ବଢ଼ାଇବା ପୂର୍ବରୁ ରଞ୍ଜନର ସମୟ ବଢ଼ାନ୍ତୁ, ଏବଂ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା ଆଗରୁ ବନ୍ଦ କରନ୍ତୁ। ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଓ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ମଧ୍ୟରେ କୌଣସି ପାର୍ଥକ୍ୟ ନଥିବା ଗାଢ଼ ନୀଳ ଜେଲ୍ ସାଧାରଣତଃ ଅତ୍ୟଧିକ ରଞ୍ଜନ କିମ୍ବା ଯଥେଷ୍ଟ ଥର ପାଣି ନବଦଳାଇବାକୁ ସୂଚାଏ। PAGE ବ୍ୟାଣ୍ଡ ଫିକା ହେବା ଆଶାକରାଯାଉଥିବା ରାସାୟନିକ ବ୍ୟବହାର, ରଞ୍ଜନ ବିଫଳ ହେବା ନୁହେଁ। ଶୀଘ୍ର ଫଟୋ ନିଅନ୍ତୁ। ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ର ଅସମାନ ପୃଷ୍ଠଭୂମି ଭାଙ୍ଗ, ବୁଦ୍ବୁଦ୍, ଆଙ୍ଗୁଠି ଚିହ୍ନ, ଅସମାନ ହଲାଇବା କିମ୍ବା କେତେକ ସ୍ଥାନରେ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣକୁ ସୂଚାଏ। ହାଇବ୍ରିଡାଇଜେସନ୍ ନିୟନ୍ତ୍ରଣ ବିନା ଏହାକୁ ଅସମାନ ଲୋଡିଂ ବୋଲି ଧରନ୍ତୁ ନାହିଁ। ବିସ୍ତାରିତ ଓ ଦୁର୍ବଳ ରାଇବୋସୋମାଲ୍ ପ୍ୟାଟର୍ନ ଅବକ୍ଷୟ ସୂଚାଇପାରେ, କିନ୍ତୁ ଅସମ୍ପୂର୍ଣ୍ଣ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ, ଅତ୍ୟଳ୍ପ ମୋଟ RNA (ସାଧାରଣ ଲେନ୍ରେ କେତେକରୁ ଦଶକ micrograms ରହେ), କିମ୍ବା ଅତ୍ୟଧିକ ରଞ୍ଜକ ହଟାଇବା ମଧ୍ୟ ଏହାର କାରଣ ହୋଇପାରେ। ଏହି ରଞ୍ଜକ ପ୍ରଚୁର ପରିମାଣରେ ଥିବା ରାଇବୋସୋମାଲ୍ RNAକୁ ସୂଚାଏ। ଏହା କୌଣସି ନିର୍ଦ୍ଦିଷ୍ଟ ଟ୍ରାନ୍ସକ୍ରିପ୍ଟକୁ ସୂଚାଏ ନାହିଁ। ସେହି କାମ ପ୍ରୋବ୍ର।
ଅତିରଞ୍ଜିତ ଦାବି ବିନା ସୁରକ୍ଷା ଓ ପରିଚାଳନା
ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ ତୁଳନାରେ ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁକୁ ପରିଚାଳନା କରିବା ସହଜ, କିନ୍ତୁ ଏହା ନିର୍ଦ୍ଦୋଷ ନୁହେଁ। MilliporeSigmaର ଏକ ବର୍ତ୍ତମାନର ସୁରକ୍ଷା ତଥ୍ୟ ପତ୍ରରେ ଏହି ରଞ୍ଜକକୁ ତୀବ୍ର ମୁଖପଥ ବିଷାକ୍ତତା ଶ୍ରେଣୀ 4, ଅର୍ଥାତ୍ ଗିଳିଲେ କ୍ଷତିକାରକ, ଭାବେ ବର୍ଗୀକୃତ କରାଯାଇଛି। Sigma-Aldrichର ମିଥିଲିନ୍ ବ୍ଲୁ SDS ଅନୁଯାୟୀ ଏହାକୁ ଅନୁମୋଦିତ ବର୍ଜ୍ୟ ନିଷ୍କାସନ ପଥରେ ପରିତ୍ୟାଗ କରିବା ଉଚିତ। ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ ପାଇଁ ଅଧିକ କଠୋର ଜିନଗତ ବିଷାକ୍ତତା ସତର୍କବାଣୀ ରହିଛି, ଯେଉଁଥିରେ ଏହାର Sigma-Aldrich ଇଥିଡିୟମ୍ ବ୍ରୋମାଇଡ୍ SDSରେ ଜନନ କୋଷ ଉପରେ ସନ୍ଦେହଜନକ ପ୍ରଭାବ ମଧ୍ୟ ଅନ୍ତର୍ଭୁକ୍ତ। Thermo Fisherର ନ୍ୟୁକ୍ଲିକ୍ ଆମ୍ଲ ରଞ୍ଜକ ନିର୍ଦ୍ଦେଶିକାରେ ଉଲ୍ଲେଖ ଅନୁଯାୟୀ, ଏହାର ଜେଲ୍ ଓ ଦ୍ରବଣକୁ ସାଧାରଣତଃ ବିପଜ୍ଜନକ ରାସାୟନିକ ବର୍ଜ୍ୟ ଭାବେ ଅଲଗା ରଖାଯାଏ। ଉଭୟ ପାଇଁ SDS ଓ ସଂସ୍ଥାଗତ ନିୟମ ମାନନ୍ତୁ। ଶୁଷ୍କ ରଞ୍ଜକକୁ ଭଲ ଭାବେ ବନ୍ଦ କରି ଶୁଷ୍କ ରଖନ୍ତୁ, କେବଳ ପ୍ରୋଟୋକଲ୍ ଅନୁମତି ଦେଲେ ବ୍ୟବହାରଯୋଗ୍ୟ ରଞ୍ଜକ ଦ୍ରବଣ ପୁନଃ ବ୍ୟବହାର କରନ୍ତୁ, ରଞ୍ଜିତ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍କୁ ଫିଲ୍ଟର୍ ସିଟ୍ ମଧ୍ୟରେ ଶୁଷ୍କ ଅବସ୍ଥାରେ ରଖନ୍ତୁ, ଏବଂ ବ୍ୟାଣ୍ଡଗୁଡ଼ିକ ବିସରଣ ହୋଇ ମିଶିଯିବା ପୂର୍ବରୁ ଜେଲ୍ର ଫଟୋ ନିଅନ୍ତୁ।
ପରୀକ୍ଷାଗାରର ଏହି ସାରକଥା ମନେ ରଖନ୍ତୁ। ଜେଲ୍ ଅଧିକ ପରିମାଣର ନମୁନାରେ ଧଳା ଆଲୋକ ତଳେ ଦୃଶ୍ୟମାନତା ପରୀକ୍ଷା କରେ। ପ୍ରୋବ୍ ସମ୍ବେଦନଶୀଳ କାମ କରିବା ପୂର୍ବରୁ ମେମ୍ବ୍ରେନ୍ ସ୍ଥାନାନ୍ତରଣ ଓ ଲୋଡିଂ ପରୀକ୍ଷା କରେ। ସୀମିତ ସମ୍ବେଦନଶୀଳତା, ପ୍ରତ୍ୟାବର୍ତ୍ତନଶୀଳ ବନ୍ଧନ ଏବଂ କାର୍ଯ୍ୟର କଠୋର କ୍ରମ ସହ ଗୋଟିଏ ରଞ୍ଜକ ଉଭୟ କାମ କରେ।