Betekent een hoger zuurstofverbruik meer ATP? Lessen uit studies met methyleenblauw

Een geïsoleerd mitochondrion bevindt zich in een meetkamer met brandstof, maar zonder ADP. Het verbruikt langzaam zuurstof. Voeg ADP toe en het zuurstofverbruik stijgt met een veelvoud. Wacht tot het ADP op is en het zuurstofverbruik daalt weer. De brandstof is niet veranderd. Alleen de vraag naar ATP is veranderd.

Die korte reeks gebeurtenissen bevat het hele onderscheid waar dit artikel over gaat. Zuurstofverbruik meet hoe snel elektronen door de ademhalingsketen naar zuurstof stromen. ATP-productie meet hoeveel van die stroom wordt vastgelegd als bruikbare energie. Beide delen een tussenstap: de protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan. Alles wat verandert hoe nauw die gradiënt aan ATP-synthese is gekoppeld, kan de twee eindpunten in verschillende richtingen bewegen. Methyleenblauw is hier een leerzaam voorbeeld, omdat beide effecten zijn waargenomen: in sommige preparaten verhoogt het zowel het zuurstofverbruik als ATP, terwijl het in andere het zuurstofverbruik verhoogt zonder dat ATP stijgt, of terwijl ATP daalt.

Lezers die eerst het bredere beeld van de elektronenoverdracht willen begrijpen, kunnen beginnen bij hoe methyleenblauw elektronen door de ademhalingsketen transporteert. Wie de terminologie van de vroege zuurstofexperimenten wil begrijpen, kan lezen wat de eerste respiratiemetingen werkelijk lieten zien.

Respiratie, ATP en de gradiënt daartussen

Elektronen uit NADH en FADH2 komen de keten binnen bij complexen I en II, gaan via complex III naar cytochroom c en vervolgens via complex IV naar zuurstof. De energie die vrijkomt bij complexen I, III en IV pompt protonen vanuit de matrix naar de intermembraanruimte. Die scheiding van elektrische lading en zuurgraad vormt de protonendrijvende kracht. Het elektrische deel daarvan, de membraanpotentiaal, is meestal de dominante component.

ATP-synthase laat protonen terugstromen naar de matrix en gebruikt de vrijgekomen energie om ADP en fosfaat samen te voegen tot ATP. De volgorde is dus:

zuurstofverbruik, dan protonenpompen, dan een gradiënt, dan ATP-synthese.

Het probleem is dat protonen ook via andere routes kunnen terugkeren. Elke terugkeer die ATP-synthase omzeilt, is een protonlek. Zo'n lek dwingt de keten om dezelfde protonen opnieuw naar buiten te pompen om de membraanpotentiaal stabiel te houden. Dat verbruikt meer zuurstof zonder meer ATP te produceren. Een voldoende sterk lek leidt tot ontkoppeling: het zuurstofverbruik stijgt terwijl ATP gelijk blijft of daalt, en de verspilde energie komt vrij als warmte.

Toestand 3, toestand 4 en de respiratoire controleverhouding

De klassieke terminologie hiervoor komt uit onderzoek met geïsoleerde mitochondriën. Toestand 3 is respiratie waarbij zowel substraat als ADP aanwezig is: ATP-synthase vermindert de gradiënt, de membraanpotentiaal daalt, de keten versnelt om die te herstellen en het zuurstofverbruik is hoog omdat er ATP wordt gemaakt. Toestand 4 is respiratie nadat het ADP op is: ATP-synthase valt stil, de gradiënt neemt toe, de hoge membraanpotentiaal belemmert verder pompen en het zuurstofverbruik daalt tot het niveau dat nodig is om het lek te compenseren.

De respiratoire controleverhouding, toestand 3 gedeeld door toestand 4, geeft daarom aan hoe nauw het preparaat gekoppeld is. Een hoge verhouding betekent dat ADP de respiratie sterk reguleert. Een dalende verhouding met een stijgende toestand 4 betekent dat het lek de overhand krijgt. Vanuit dit perspectief worden de onderstaande resultaten met methyleenblauw begrijpelijk.

Eén denkmodel is het onthouden waard. Een hoge membraanpotentiaal vertraagt de keten. Het afbouwen van die potentiaal versnelt de keten. De keten reageert op hoe moeilijk het pompen is geworden, niet rechtstreeks op de vraag of er ATP wordt gemaakt.

Wanneer de eindpunten samen veranderen

Het duidelijkste voorbeeld van koppeling komt uit onderzoek naar geïsoleerde hersenmitochondriën van cavia's met geblokkeerde ademhalingscomplexen. Bij 100 nanomolair tot 1 micromolair methyleenblauw nam het zuurstofverbruik in rust toe met glutamaat plus malaat, succinaat of glycerofosfaat als brandstof, terwijl de door ADP gestimuleerde respiratie onveranderd bleef. In mitochondriën waarin complex I of complex III door een gifstof was geremd, verhoogde de kleurstof de ATP-productie bescheiden, herstelde zij de membraanpotentiaal en verbeterde zij de calciumopname. De voorgestelde route is een omweg: de kleurstof neemt elektronen op vóór de blokkade en geeft ze door aan cytochroom c, waarbij het beschadigde complex wordt omzeild.

Een tweede geval waarin beide samen veranderen, gebruikt een heel andere ATP-bron. In geïsoleerde hersenmitochondriën waarin ATP-synthase was geremd stimuleerde methyleenblauw nog steeds de respiratie bij elk getest substraat. Maar de ATP-synthese nam alleen toe bij alfa-ketoglutaraat en glutamaat, de twee substraten waaruit succinyl-CoA wordt gevormd. Omdat oligomycine ATP-synthase blokkeerde, kwam het extra ATP uit fosforylering op substraatniveau door succinyl-CoA-ligase in de citroenzuurcyclus, niet uit oxidatieve fosforylering. De kleurstof herstelde ook de membraanpotentiaal wanneer complex I en ATP-synthase tegelijk werden geremd. Hier namen zuurstofverbruik en ATP samen toe, maar alleen waar het substraat de tweede ATP-route mogelijk maakte. Bij succinaat of malaat nam de respiratie toe zonder extra ATP. Dezelfde kleurstof, dezelfde meetkamer, een andere brandstof, een ander antwoord.

Wanneer de eindpunten uiteenlopen

De gevallen waarin de eindpunten uiteenlopen, zijn eveneens gepubliceerd en even leerzaam. In een studie uit 1997 met geïsoleerde levermitochondriën van ratten versnelde methyleenblauw de respiratie in toestand 4 bij nauw gekoppelde mitochondriën die succinaat gebruikten, waardoor de respiratoire controleverhouding daalde. Het effect was zichtbaar vanaf 0.5 micromolair en sterk bij 5 micromolair, een concentratie dicht bij de plasmaspiegels na een intraveneuze bolus van 100 milligram. Bij 5 micromolair zwollen de mitochondriën ook op, maar het koppelingsdefect trad al bij lagere concentraties op. Dat wijst erop dat het lek voorafging aan de structurele schade, in plaats van erdoor te worden veroorzaakt. In ontkoppelde mitochondriën stimuleerde de kleurstof de respiratie op een verzadigbare, concentratieafhankelijke manier. Het zuurstofverbruik steeg in beide preparaten. De ATP-synthese per hoeveelheid verbruikte zuurstof niet. Dat is een schoolvoorbeeld van ontkoppeling plus elektronentransport door hetzelfde molecuul.

Het opvallendste verschil komt uit het netvlies. Bij muizen met een AIF-tekort en met rotenon behandelde fotoreceptorcellen behield methyleenblauw de netvliesdikte, fotoreceptormarkers en mitochondriale structuur. Het verlaagde ook de verhouding tussen NADH en NAD en dempte stressroutes, waaronder de respons op ongevouwen eiwitten en mitofagie. Dit gebeurde zonder het ATP-tekort te verhelpen. Bescherming zonder herstel van de energievoorziening betekent dat het voordeel verliep via de redoxbalans en mitochondriale integriteit, niet via extra ATP. Wie het overleven van het weefsel gelijkstelt aan herstelde energieproductie, zou dat experiment volledig verkeerd interpreteren.

Het onderzoek met hersenmitochondriën voegt een kostenpost toe aan hetzelfde overzicht. Dezelfde lage concentraties die de bio-energetica verbeterden, verhoogden ook de productie van waterstofperoxide onder alle geteste omstandigheden en vertraagden de verwijdering ervan. Dit werd gemeten met een gekalibreerde Amplex-assay in plaats van een niet-specifieke kleurstof. Meer ATP en meer oxidant gingen hand in hand.

Een praktische leeschecklist

Vier vragen onderscheiden een gekoppeld resultaat van een ontkoppeld resultaat.

Ten eerste: welk eindpunt werd daadwerkelijk gemeten? Zuurstofverbruik alleen kan niets zeggen over ATP. ATP-synthese, membraanpotentiaal en de respiratoire controleverhouding voegen elk een stukje informatie toe dat de zuurstofelektrode niet kan waarnemen. De gids voor het beoordelen van onderzoeksclaims over methyleenblauw behandelt deze zorgvuldige omgang met eindpunten uitvoerig.

Ten tweede: welk substraat voedde de mitochondriën? Het resultaat met succinyl-CoA laat zien dat de brandstofkeuze kan bepalen of extra respiratie überhaupt extra ATP kan opleveren.

Ten derde: welke concentratie werd gebruikt? Nanomolaire tot lage micromolaire concentraties methyleenblauw in hersenmitochondriën leverden bescheiden bio-energetische verbeteringen op, maar ook meer oxidant. Vanaf een halve micromolair verminderde de koppeling in levermitochondriën; bij 5 micromolair kwam daar zwelling bij. Concentratie maakt deel uit van het mechanisme en is geen achtergronddetail.

Ten vierde: in welk model werd het resultaat gevonden? Geïsoleerde mitochondriën onthullen de interne verbindingen, maar intacte cellen en weefsels voegen transport, reductie tot de kleurloze vorm en concurrerende routes die elektronen opnemen toe. Onderzoek naar dosering in het laboratorium, waaronder hoe concentratie en protocol de effecten van methyleenblauw bepalen, vormt de brug tussen meetwaarden uit de meetkamer en elke claim over een persoon.

Zuurstofverbruik geeft de elektronenstroom weer. ATP geeft aan hoeveel van die stroom werd vastgelegd. Methyleenblauw kan beide veranderen, en de bovenstaande experimenten laten alle vier de daaruit voortvloeiende combinaties zien: beide nemen toe, respiratie neemt alleen toe waar het substraat dat toelaat, respiratie neemt toe terwijl de koppeling afneemt, en weefsel blijft behouden terwijl ATP gelijk blijft. Het getal op de zuurstofelektrode is het begin van de interpretatie, niet het einde ervan.