Methyleenblauw en hormesis: waarom dosis-responscurven van richting kunnen veranderen

Een rat krijgt na het leren herkennen van een voorwerp 4 milligram per kilogram methyleenblauw en herinnert het zich de volgende dag. Een andere rat krijgt 50 en draait nauwelijks nog aan zijn loopwiel. Het molecuul is hetzelfde. De richting van het effect niet. Iedereen die meer dan een paar artikelen over methyleenblauw heeft gelezen, is deze omkering tegengekomen. Ze heeft een naam: hormesis, een bifasische respons waarbij lage en hoge blootstellingen hetzelfde eindpunt in tegengestelde richtingen beïnvloeden.

De naam is alleen nuttig als je weet wat die wel en niet belooft. Dit artikel bespreekt vier gepubliceerde datasets over methyleenblauw, elk met een eigen eindpunt, concentratiebereik en experimentele opzet, en laat zien waarom de chemie van de kleurstof zulke omkeringen aannemelijk maakt. Het eindigt met de waarschuwing die de gegevens noodzakelijk maken: een curve die in één experiment piekt, beschrijft dat experiment en is geen methode om een persoonlijke dosis te kiezen.

Het patroon heeft een naam, en die naam betekent minder dan je denkt

De term hormesis werd in 1943 geïntroduceerd door Southam en Ehrlich en kreeg zijn moderne kwantitatieve vorm van Calabrese en Baldwin: een adaptieve bifasische respons die rechtstreeks ontstaat of door compensatie na verstoring van de homeostase. Let op wat in die definitie ontbreekt. Het woord gunstig komt er niet in voor. Hormesis zegt dat de curve van richting verandert, niets meer.

De vorm die je ziet, hangt af van het eindpunt op de verticale as. Wanneer het eindpunt een positieve functie is, zoals enzymactiviteit, zuurstofgebruik of een geheugenscore, levert stimulatie bij een lage dosis gevolgd door remming bij een hoge dosis een omgekeerde U op. Wanneer het eindpunt iets ongunstigs is, zoals ziekte-incidentie, levert onderdrukking bij een lage dosis gevolgd door versterking bij een hoge dosis een J of U op. Dezelfde relatie, een andere ordinaat. Het meeste onderzoek naar methyleenblauw meet positieve functies. Daarom spreekt dit artikel over omgekeerde U-curven, met de kanttekening dat de letter van het alfabet een keuze in de grafische weergave is.

Het overzichtsartikel uit 2008 waarin de hormetische responsen van methyleenblauw zijn verzameld maakt de schaal concreet. Bij gedrag, fysiologie en biochemie bereiken responsen binnen de stimulerende zone ongeveer 130 tot 160 procent van de controlewaarde, met een gemiddelde rond 140. Daarna dalen ze weer tot de controlewaarde en vervolgens daaronder naarmate de dosis verder stijgt. Die bandbreedte vat vele experimenten samen en is geen eigenschap van het molecuul. Elke onderstaande curve heeft haar eigen piek in haar eigen eenheden.

Waarom juist dit molecuul een omkering kan laten zien

Methyleenblauw is niet simpelweg een elektronendonor. Het is een omkeerbare shuttle. De geoxideerde blauwe vorm neemt elektronen op en wordt de kleurloze gereduceerde vorm. Die gereduceerde vorm kan de elektronen vervolgens verderop doorgeven. De elektronenoverdracht achter deze curven wordt beschreven in de uitleg over hoe methyleenblauw elektronen verplaatst. Die shuttlefunctie staat hier centraal.

Bij lage concentraties biedt die cyclus de cellulaire respiratie een alternatieve route. De gereduceerde kleurstof kan worden geoxideerd bij cytochroomoxidase, het laatste enzym van de elektronentransportketen. Daardoor nemen de omzettingssnelheid van het enzym, het zuurstofgebruik en de respiratoire capaciteit toe. Bij hogere concentraties begint dezelfde chemie met haar sterke neiging om elektronen op te nemen met de normale keten te concurreren in plaats van die te ondersteunen: elektronen worden van hun gebruikelijke route afgeleid, zuurstof wordt rechtstreeks verbruikt en er ontstaan reactieve zuurstofsoorten in plaats van bruikbare energie. Een kleine katalytische shuttle geeft meer doorstroming; een overmatige, concurrerende elektronenafvanger geeft minder. De chemie maakt een richtingsverandering aannemelijk, maar garandeert niets over waar een bepaald eindpunt zal pieken.

Onafhankelijk bewijs voor de concentratieafhankelijkheid komt uit cellen die helemaal geen mitochondriën hebben. In de erytrocytenexperimenten uit 1976 stimuleerde een lage concentratie van 1 micromolair de hexosemonofosfaatshunt via een route die sterk afhankelijk was van oxyhemoglobine. Een honderdmaal hogere concentratie van 0.1 millimolair was daarentegen nauwelijks afhankelijk van de aanwezigheid van oxyhemoglobine en genereerde waterstofperoxide volgens alle drie de gebruikte bepalingsmethoden. Dezelfde kleurstof, twee mechanismen, gescheiden door de concentratie. Rode bloedcellen kunnen geen mitochondriale respiratie uitvoeren, dus dit is geen mitochondriale curve. Het laat wel zien dat de redoxchemie van de kleurstof van karakter verandert naarmate de concentratie stijgt, precies wat de mitochondriale verklaring vereist.

Vier curven, vier opzetten

De onderstaande figuur geeft de vier datasets opnieuw weer, naast elkaar. Elk paneel behoudt zijn eigen assen en omstandigheden, want ze op één schaal over elkaar leggen zou de eerste onwaarheid van dit artikel zijn. De tekening is schematisch; de exacte waarden en omstandigheden staan in de tekst.

Paneel A: cytochroomoxidase in rattenhersenhomogenaat. De duidelijkste mitochondriale curve komt uit een secundaire bron: het overzichtsartikel geeft haar weer op basis van gegevens uit rattenhersenhomogenaat. De activiteit bedraagt ongeveer 138 procent van de controlewaarde bij 0.5 micromolair, keert rond 5 micromolair terug naar de controlewaarde en daalt rond 10 micromolair onder de uitgangswaarde. Bij die laatste concentratie suggereren de auteurs dat de kleurstof elektronen wegneemt van de normale complexen van de keten. Homogenaat, micromolair, spectrofotometrische bepaling. Die zin bevat de volledige context, en buiten die context zegt de curve niets.

Paneel B: rattengeheugen en lopen in een loopwiel. In het onderzoek naar rattengeheugen werd 24 uur na eenmalige injecties na de training getest. Bij doses van 1 tot 10 milligram per kilogram waren locomotorische activiteit en voedselopname niet te onderscheiden van die bij een zoutoplossing. Bij 50 tot 100 milligram per kilogram nam het lopen in het loopwiel sterk af (mediaan 35 tegenover 279 omwentelingen), en de hoogste dosis veroorzaakte pilo-erectie, ongecoördineerde bewegingen en één sterfgeval. De dosis van 4 milligram per kilogram verbeterde gewenning en voorwerpherkenning: behandelde ratten besteedden bijna 10 seconden meer aan het nieuwe voorwerp. Het zuurstofverbruik in de hersenen nam toe, zowel in homogenaat dat werd blootgesteld aan lage micromolaire concentraties gereduceerde kleurstof als in hersenen die 24 uur na toediening van 1 milligram per kilogram in vivo werden afgenomen. Let op het onderscheid: voor gedrag werden systemische doses na de training gebruikt; voor zuurstofgebruik werden homogenaatconcentraties plus één dosis in vivo gebruikt. Het gaat om twee experimenten, niet om één curve.

Paneel C: T-doolhof bij zebravissen. In het onderzoek met zebravissen werden getrainde vissen na de training gedurende 12 uur ondergedompeld in nominale badconcentraties van 0.1, 0.5, 5.0 of 10.0 micromolair, met een blauwe voedingskleurstof als controle. De groep van 0.5 micromolair presteerde het best, de groep van 5.0 kwam overeen met de controle en de groep van 10.0 presteerde slechter dan de groepen met lagere doses. Bij dit paneel horen twee kanttekeningen. Een micromolaire concentratie in het bad is geen micromolaire concentratie in bloed of hersenen; distributie en ophoping staan tussen het aquariumwater en het weefsel. Bovendien is de statistische onderbouwing zwakker dan de vorm suggereert: de hoge dosis verschilde van de groepen met lagere doses, maar er werden geen andere significante verschillen tussen groepen gerapporteerd. De curve is reëel, maar grof.

Paneel D: de erytrocytenshunt. Metz en collega's vergeleken 1 micromolair met 0.1 millimolair in menselijke rode bloedcellen onder lucht, koolmonoxide en een mengsel dat bij een fysiologische zuurstofdruk bijna volledige omzetting naar carboxyhemoglobine gaf. Zonder oxyhemoglobine viel de stimulatie bij de lage dosis weg; de stimulatie bij de hoge dosis veranderde nauwelijks. Peroxide verscheen alleen bij de hoge dosis. Dit paneel hoort als chemische vergelijking naast de andere, niet als vierde punt op een overkoepelende curve: geen mitochondriën, een honderdvoudig concentratieverschil en gemanipuleerde gasmengsels.

Waarom de pieken niet overeenkomen, en ook niet zouden moeten

De vier pieken liggen bij 0.5 micromolair in een homogenaat, 4 milligram per kilogram geïnjecteerd na de training, 0.5 micromolair in aquariumwater en een vergelijking tussen laag en hoog met een honderdvoudig verschil in rode bloedcellen. Twee daarvan behandelen als hetzelfde getal is een categoriefout. Elk eindpunt heeft zijn eigen curve: het optimum voor geheugen hoeft niet overeen te komen met het optimum voor oxidaseactiviteit, zuurstofverbruik, locomotorische activiteit of peroxideproductie. Elke concentratie-eenheid betekent iets anders: micromolaire concentraties in homogenaat, nominale micromolaire badconcentraties, systemische doses in milligram per kilogram en concentraties in plasma, hersenen en mitochondriën zijn verschillende grootheden. De neiging van methyleenblauw om zich in mitochondriën en hersenen op te hopen houdt die verschillen in stand. Elk model voegt zijn eigen farmacokinetiek toe: diersoort, toedieningsroute en timing bepalen welk weefsel met hoeveel kleurstof in contact komt en hoelang.

Hier is ook de rol van dosis en toedieningsroute bij de veiligheid van methyleenblauw van belang. De effecten bij hoge doses in deze artikelen — onderdrukking van motorische activiteit, ongecoördineerde bewegingen, één dode rat en peroxidevorming — zijn namelijk signalen van toxiciteit binnen hun eigen opzet, geen veiligheidsmarges voor anderen. Wie geneigd is om 4 milligram per kilogram bij een rat om te rekenen naar een doseringsschema voor mensen, moet eerst lezen hoe bevindingen bij dieren zich verhouden tot bewijs bij mensen: een eenvoudige omrekening op basis van milligram per kilogram tussen soorten is ontoereikend.

De fout die je moet vermijden

De omgekeerde U is verleidelijk omdat ze eruitziet als een doseerknop waarop het ideale punt is gemarkeerd. Dat is ze niet. Hormesis beschrijft wat er met één eindpunt in één opzet gebeurde. Stapel vier van zulke beschrijvingen op elkaar en je krijgt vier pieken in vier eenhedenstelsels, precies het tegenovergestelde van een doseerknop. Een eerlijk gebruik van deze curven is vergelijkend en waarschuwend: verwacht dat effecten met de concentratie van richting veranderen, verwacht dat elk eindpunt op zijn eigen punt omslaat en wantrouw elke claim die de piek uit het ene experiment gebruikt om een dosis te rechtvaardigen bij een andere soort, toedieningsroute, weefsel of doelstelling. Het onderscheid tussen experimentele patronen en persoonlijke doseringsbeslissingen is de kern van dit hele artikel, hier nogmaals benoemd zodat het niet wordt gemist.

Hoe je het volgende artikel over dosis-respons leest

Vier vragen passen bij vrijwel elke methyleenblauwcurve die je tegenkomt. Welk eindpunt staat op de verticale as, en zou de omkering ervan een U of een J opleveren? Welke concentratie geeft de horizontale as daadwerkelijk weer: nominaal bad, homogenaat, plasma, geschatte hersenconcentratie of toegediende systemische dosis? Welk model en welke timing leverden de curve op: homogenaat, celkweek met het licht aan of uit, getrainde dieren die vóór of na de training een dosis kregen, en wanneer werden ze getest? En wat was de controle: zoutoplossing, blauwe voedingskleurstof of het vehiculum, en ondersteunen de statistieken van het artikel elke bewering over paarsgewijze verschillen of alleen de algemene vorm? Een artikel dat alle vier beantwoordt, is je tijd waard. Een artikel dat zonder die informatie een piek rapporteert, heeft je een getal zonder adres gegeven.