Methyleenblauw en Bartonella: laboratoriumbevindingen en grenzen van het klinische bewijs

Een kweekschaal en een patiënt delen een woord, infectie, maar niet hetzelfde concept. In de schaal gaat het bij infectie om een telling van kolonies op agar. Bij de patiënt gaat het om bacteriën in cellen en bloedvaten, geneesmiddelen die zich door bloed en weefsels verplaatsen, en een immuunsysteem dat een deel van het werk doet. Wie die twee verwart, kan een opvallend laboratoriumgetal voor een behandeling aanzien. Houd ze gescheiden en hetzelfde getal blijft wat het is: een reden om het volgende experiment uit te voeren.

Dat onderscheid bewaken is het hele doel van dit overzicht van methyleenblauw en Bartonella. Twee laboratoriumstudies van één onderzoeksgroep testten methyleenblauw tegen Bartonella henselae in niet-groeiende toestanden. Beide rapporteerden sterke activiteit in glas en plastic. Geen van beide onderzocht een mens.

Waarom onderzoekers de stationaire fase testen

Bij de meeste antibioticatests worden groeiende cellen gebruikt. Dat model mist een moeilijker geval: cellen die gestopt zijn met delen en middelen verdragen die hun groeiende soortgenoten doden.

Bartonella kan in het lichaam blijven voortbestaan, onder meer in erytrocyten en endotheelcellen. Daarom onderzocht de groep welke goedgekeurde geneesmiddelen B. henselae kunnen doden nadat de bacterie de stationaire fase heeft bereikt. Een lage MIC bij groeiende cellen voorspelde geen doding in de stationaire fase. Rifampicine had een zeer lage MIC, maar doodde stationaire cellen slecht, terwijl verbindingen met hogere MIC-waarden ze goed doodden. Lezers die een algemene methode zoeken om dit soort publicaties te beoordelen, vinden die in de gids voor het lezen van onderzoek naar methyleenblauw.

Eerste screening: Li en collega's, 2019

De screening van de stationaire fase uit 2019 in Antibiotics gebruikte één stam, B. henselae JK53, gekweekt in Schneider-medium met 10 procent foetaal runderserum bij 37 C en 5 procent CO2. Culturen van één dag oud bestonden voornamelijk uit verspreide, delende cellen. Culturen van vijf dagen oud, met ongeveer 10 tot de 8e macht kolonievormende eenheden per mL, werden beschouwd als stationairefaseculturen en bevatten zichtbare aggregaten.

De test gebruikte SYBR Green I met propidiumjodide, gekalibreerd tegen mengsels van levende cellen en cellen die met isopropanol waren gedood. Omdat methyleenblauw sterk gekleurd is, werden positieve resultaten bevestigd met microscopie en vervolgens met kolonietellingen op bloedagar, het strengere eindpunt.

Bij een screening van 1,581 goedgekeurde geneesmiddelen bij 50 micromolair liet methyleenblauw een levensvatbaarheid van 16 procent over volgens de plaatlezer en 25 procent volgens microscopie. Daptomycine scoorde 21 procent, verschillende azolen 22 tot 27 procent, gentamicine 32 procent, erytromycine 66 procent en ciprofloxacine 74 procent. Pyrviniumpamoaat leek sterker volgens de plaatlezer, maar kon door zijn eigen fluorescentie niet met microscopie worden beoordeeld.

Bij groeiende B. henselae bedroeg de MIC van methyleenblauw 0.08 tot 0.16 microgram per mL. Bij stationaire cellen van vijf dagen oud, blootgesteld aan 5 microgram per mL, daalde het aantal kolonies na één dag blootstelling tot geen detecteerbare kolonies. Dat kwam overeen met daptomycine en pyrviniumpamoaat bij hun geteste concentraties. Een afzonderlijke test van de doding in de tijd gebruikte 10 microgram per mL. Dit zijn blootstellingsniveaus in het laboratorium, geen doses, en de publicatie beschrijft ze ook zo. Een aangehaalde piekplasmawaarde bij mensen van ongeveer 3.9 microgram per mL verschijnt in de publicatie uitsluitend als achtergrondinformatie. Het overzicht van de farmacokinetiek van methyleenblauw legt uit waarom een plasmawaarde niet als een weefselwaarde kan worden gelezen.

Twee beperkingen worden expliciet genoemd in de publicatie. Er was geen biofilmmodel en er werden geen combinaties met methyleenblauw getest. De aggregaten van vijf dagen oud waren clusters in een stationaire vloeibare cultuur, geen gevalideerd biofilmexperiment. De auteurs pleitten voor dieronderzoek, combinatieonderzoek, biofilmonderzoek en tests bij andere Bartonella-soorten.

Combinaties en cellen afkomstig uit biofilms: Zheng en collega's, 2020

Het vervolgonderzoek uit 2020 in BMC Microbiology gebruikte dezelfde stam en hetzelfde medium, maar stapte over op stationaire culturen van zes dagen oud en voegde twee zaken toe die in de eerste publicatie ontbraken: combinaties van twee middelen en een model met cellen afkomstig uit biofilms.

Bij afzonderlijke middelen, allemaal getest bij 5 microgram per mL gedurende 24 uur, liet methyleenblauw 3.2 maal 10 tot de 4e macht kolonievormende eenheden per mL over, tegenover ongeveer 2.8 maal 10 tot de 10e macht in de controle. Ciprofloxacine, gentamicine en nitrofurantoïne lieten op hetzelfde tijdstip minder kolonies over. Dat wijkt af van het resultaat uit 2019, waarbij hetzelfde nominale niveau na één dag geen detecteerbare kolonies opleverde. De leeftijd, dichtheid en verwerking van de culturen verschilden. De doding was dus reproduceerbaar in richting, maar niet identiek in omvang. Deze variatie tussen experimenten is een van de redenen waarom standaardcontroles op veiligheid en interacties de werkzaamheid in het laboratorium los van het klinische effect beoordelen.

De combinatiescreening is het meest aangehaalde onderdeel. Elke component werd op 5 microgram per mL gehouden. Zowel azitromycine plus methyleenblauw als rifampicine plus methyleenblauw leverde na 24 uur geen detecteerbare kolonies in de stationaire fase op. Dat gold ook voor beide combinaties met ciprofloxacine, en alleen voor die vier van de 25 geteste combinaties. Er werd geen formele synergieanalyse uitgevoerd. De juiste term is daarom een actieve combinatie onder deze omstandigheden, niet bewezen synergie.

Het biofilmexperiment testte cellen die waren teruggewonnen uit een jonge, verstoorde biofilm, niet de penetratie in een intacte, rijpe biofilm. Culturen werden vijf dagen gekweekt, verdund en nog vijf dagen in platen met wells gekweekt, bevestigd met kristalvioletkleuring en vervolgens afgeschraapt vóór blootstelling aan de middelen. Bij 5 microgram per mL daalde het aantal met alleen methyleenblauw op dag 6 tot 2.3 maal 10 tot de 2e macht. Daarmee behoorde het tot de beste afzonderlijke middelen, maar het aantal bereikte geen nul. Beide combinaties met methyleenblauw bereikten op dag 6 nul, net als beide combinaties met ciprofloxacine.

De auteurs benoemden dezelfde beperkingen die een zorgvuldige lezer zou opmerken: een jonge, afgeschraapte biofilm in plaats van een oude, intacte biofilm; één praktisch gekozen concentratie voor alle middelen in plaats van elk middel bij zijn eigen realistische piekconcentratie; alleen geselecteerde combinaties met azitromycine of rifampicine; één stam; geen dieren; geen patiënten. Later onderzoek met drie middelen werd voorgesteld, niet gerapporteerd.

Vergelijking van de onderzoeksopzet

De tabel vat de kern van dit artikel samen. Alles links van de laatste kolom is kweekonderzoek. Geen van beide publicaties levert gegevens voor de laatste kolom.

Bartonella is geen Borrelia

Beide publicaties noemen Borrelia burgdorferi, de spirocheet die de ziekte van Lyme veroorzaakt, omdat de kleurstoftest afkomstig was uit eerder onderzoek naar de stationaire fase van Borrelia in hetzelfde laboratorium. Daar waren methyleenblauw en daptomycine ook als actieve middelen naar voren gekomen. Die voorgeschiedenis biedt nuttige context, maar is ook een veelvoorkomende bron van fouten.

Geen enkel experiment in een van de Bartonella-publicaties test Borrelia naast Bartonella. Organismen verschillen, media verschillen, concentraties verschillen, en het veronderstelde membraaneffect van methyleenblauw bij Bartonella werd beschreven als een speculatie die nader onderzoek vereist. Resultaten mogen niet van de ene soort naar de andere worden overgedragen, en geen van beide publicaties ondersteunt brede uitspraken over parasieten. De vergelijking van persistercellen van Borrelia en Bartonella houdt de twee onderzoeksliteraturen om deze reden gescheiden.

Waarom kweekresultaten geen protocol worden

De belangstelling voor een protocol voor methyleenblauw bij Bartonella is begrijpelijk. Deze publicaties laten zien waarom die zoekterm eerder als een waarschuwingssignaal dan als een boodschappenlijst moet worden beschouwd.

Ten eerste is 5 microgram per mL in een well geen voorschrift. Daaraan zijn geen gegevens gekoppeld over absorptie, distributie, eiwitbinding, intracellulaire penetratie of verdraagbaarheid. De auteurs kozen deze waarde als een ruw gemiddelde van piekconcentraties van antibiotica en stelden dat toekomstig onderzoek elk middel op zijn eigen realistische niveau moet testen.

Ten tweede betekent nul kolonies dat er onder die uitplaatomstandigheden geen kolonies zijn, niet dat het weefsel steriel is. Persistercellen, intracellulaire bacteriën en beperkingen van de monstername vallen allemaal buiten de agarplaat.

Ten derde kunnen combinaties die een well steriliseren in een lichaam falen of schade veroorzaken. Azitromycine plus methyleenblauw en rifampicine plus methyleenblauw zijn laboratoriumcombinaties bij blootstellingsniveaus uit het laboratorium. Zonder farmacokinetisch onderzoek bij dieren en gecontroleerde gegevens bij mensen is er geen vastgestelde dosis, duur of baten-risicoverhouding. Wie opties afweegt, moet die met een arts bespreken en nagaan wanneer het gebruik van methyleenblauw medisch toezicht vereist, voordat er conclusies worden getrokken uit gegevens uit kweekschalen.

De beperkte conclusie die deze publicaties wel ondersteunen, is deze: methyleenblauw heeft reproduceerbare activiteit tegen niet-groeiende B. henselae JK53 in vitro, ook in laboratoriumcombinaties van twee middelen. De sterkste resultaten voor combinaties en cellen afkomstig uit biofilms komen uit het onderzoek van 2020. Al het overige, inclusief de vraag of die activiteit relevant is voor bartonellose bij mensen, blijft ongetest.