Absorptiespectrum en molaire absorptiviteit van methyleenblauw: een naslagwerk met meetcondities

Een spectrum van methyleenblauw lijkt eenvoudig, totdat je er een getal uit probeert te hergebruiken. Het ene laboratorium rapporteert een molaire extinctiecoëfficiënt van ongeveer 82,000. Een ander rapporteert 67,000. Een derde rapporteert meer dan 100,000. Alle drie kunnen hun eigen metingen correct beschrijven, maar geen van deze waarden is een universele constante voor de kleurstof.

De verwarring ontstaat doordat twee verschillende begrippen door elkaar worden gehaald. Absorbantie is een meting aan een specifieke oplossing in een specifieke cuvet. Molaire absorptiviteit, vaak aangeduid als epsilon, is een parameter in een model van die oplossing. Wanneer de associatietoestand van methyleenblauw verandert, verandert het model en dus ook de parameter. Een nuttige gewoonte is om elke coëfficiënt te behandelen als een waarde met bijbehorende condities: golflengte, oplosmiddel, pH of buffer, temperatuur, concentratiebereik en weglengte horen bij het getal.

De monomeerband in verdunde waterige oplossingen

In een verdunde waterige oplossing ligt de dominante band van het methyleenblauwkation rond 664 tot 665 nm. Afhankelijk van het instrument en de kalibratie wordt doorgaans een waarde binnen 664 tot 668 nm genoemd. Die band is de juiste keuze voor kwantificering wanneer de oplossing zo verdund is dat het grootste deel van de kleurstof als monomeer aanwezig is.

Drie literatuurwaarden laten zien waarom de condities belangrijker zijn dan het getal op zichzelf. Kleionderzoekers die waterige monsters onder ongeveer 7 micromolar hielden en cuvetten van 1 cm gebruikten, rapporteerden een epsilon van ongeveer 82,000 M-1 cm-1 bij 665 nm. Die waarde is uitzonderlijk goed gedocumenteerd als een empirische kalibratiehelling voor zeer verdunde waterige monsters. Een latere primaire kalibratie in gedeïoniseerd water, met 2.34 tot 37.52 micromolar en een weglengte van 1 cm, leverde ongeveer 67,100 M-1 cm-1 bij 665 nm op voor de totale kleurstof. Het lagere resultaat is te verwachten en niet tegenstrijdig, omdat de bovenste helft van dat kalibratiebereik al een aanzienlijke hoeveelheid dimeer bevat. Een derde waarde, ongeveer 73,460 M-1 cm-1 bij 664 nm, komt uit onderzoek bij pH 6.86 en 293 K waarin het waargenomen spectrum werd opgesplitst in monomeer- en dimeercomponenten, zoals samengevat in een recent kritisch overzicht van de fotofysica van methyleenblauw. Dat getal betreft een door deconvolutie verkregen monomeercomponent, niet de directe helling van absorbantie uitgezet tegen de totale kleurstofconcentratie.

De praktische les: kies de coëfficiënt waarvan de condities overeenkomen met je monsters, of voer je eigen kalibratie uit. Neem niet zomaar 82,000 over voor een bepaling in fosfaatbuffer bij 30 micromolar en veronderstel niet dat de lineariteit nog steeds geldt.

De schouder bij kortere golflengten is een mengsel

Naarmate de concentratie stijgt, groeit een schouder rond 600 tot 615 nm ten opzichte van de piek bij 664 nm. Recent onderzoek plaatst de bijdrage van het H-type dimeer doorgaans rond 605 tot 610 nm. De globale spectrale analyse van methyleenblauw in water onderscheidt een dimeermaximum bij 607 nm en een maximum van een hoger aggregaat bij 600 nm, met monomeerresonantiecomponenten bij 664 en 650 nm. De volledige tekst is beschikbaar via de openaccessvermelding voor PMID 33251415.

Die schouder mag niet als zuivere dimeerabsorbantie worden aangeduid. De vibronische structuur van het monomeer draagt ook bij in hetzelfde gebied, waardoor de gemeten hoogte een superpositie is. Bij één globale fit bleek een monomeer-dimeermodel ontoereikend over het volledige bereik van 1.1 micromolar tot 3.4 millimolar. Toevoeging van een tetrameer gaf de beste fit, waarbij het tetrameersignaal al onder 34 micromolar detecteerbaar was. De uit de fit verkregen componentsterkten waren groot: ongeveer 107,800 M-1 cm-1 bij 664 nm voor de belangrijkste monomeercomponent, ongeveer 101,400 voor het dimeer bij 607 nm en ongeveer 138,500 voor het tetrameer bij 600 nm, in ongebufferd gedeïoniseerd water met natriumchloride van 0 tot 0.15 M en temperaturen van 282 tot 333 K. Dit zijn met een model onderscheiden componenten en ze mogen daarom niet worden gebruikt ter vervanging van een empirische Beer-Lambert-helling.

De sterkte van de dimerisatie is rechtstreeks gekwantificeerd. Bij pH 6.86 en 293 K vond één studie een dimerisatieconstante van ongeveer 3,900 M-1. Die grootte verklaart waarom een werkoplossing van 5 micromolar zich vrijwel lineair gedraagt, terwijl een voorraadoplossing van 50 micromolar dat niet doet. Een nuttige controle tijdens de methodeontwikkeling is de verhouding tussen de absorbantie rond 610 nm en die rond 665 nm. Wanneer die verhouding met de concentratie toeneemt, beschrijft epsilon bij 664 nm niet langer één onveranderlijke soort.

Binnen een concentratie-interval waarin één paar onderling omzetbare soorten domineert, kunnen spectra een isosbestisch punt delen. In waterige reeksen ligt dat experimenteel rond 625 nm. Een duidelijk, onveranderlijk snijpunt past bij twee dominante soorten. Wanneer het punt bij stijgende concentratie verschuift of verdwijnt, beschouw dat dan als een waarschuwing dat hogere aggregaten of verschuivende evenwichten een rol zijn gaan spelen, niet als een instrumentfout.

Oplosmiddel, pH en temperatuur verschuiven het spectrum

Water bevordert associatie. Toevoeging van dimethylsulfoxide onderdrukt dimerisatie, verschuift de absorptie- en fluorescentiemaxima naar langere golflengten en verhoogt de fluorescentiekwantumopbrengst ongeveer viervoudig, volgens de oplosmiddelstudie van methyleenblauw in water en DMSO-mengsels, geïndexeerd als PMID 30933781. Dat onderzoek behandelt waterige spectra als een monomeer-dimeerevenwicht met monomeerabsorbantie rond 650 tot 670 nm en dimeerabsorbantie rond 580 tot 615 nm, en leidt dimerisatieconstanten af uit de spectra bij 293.15 K.

Alcoholen verschuiven zowel de positie als de schijnbare sterkte, maar heffen aggregatie niet op. In één primaire vergelijking bij 31.3 micromolar en kamertemperatuur, beschreven in een oplosmiddelstudie van methyleenblauw, lag het maximum bij lange golflengten op 665 nm in water, maar op 655 nm in methanol. De schijnbare waarden voor de totale oplossing waren ongeveer 37,100 in water en 60,800 in methanol. Een afzonderlijke validatie in absolute ethanol bij 298 K leverde een maximum bij 655 nm op, met een epsilon van ongeveer 68,000.

Gangbare pH-veranderingen verschuiven het spectrum minder dan veel protocollen veronderstellen. Het hierboven aangehaalde kritische overzicht meldt dat het maximum van ongeveer pH 2 tot pH 12 rond 665 nm bleef, met slechts kleine veranderingen in sterkte tot en met pH 11. Het type buffer en de ionsterkte kunnen resultaten even sterk beïnvloeden als de nominale pH. Noteer daarom de daadwerkelijk gebruikte buffer en het zout, niet alleen de aflezing van de pH-meter. Sterk zure of sterk alkalische omstandigheden vormen een apart geval, omdat de kleurstof dan chemische veranderingen kan ondergaan in plaats van reversibele associatie. Temperatuur en zout verschuiven het evenwicht eveneens; daarom werden beide bewust gevarieerd in de waterstudie uit 2020.

Zo meten dat het getal geldig blijft

Kwantitatief werk berust op de wet van Beer-Lambert: absorbantie is gelijk aan epsilon maal concentratie maal weglengte. Daarnaast moet worden aangetoond dat het lineaire interval onder jouw condities daadwerkelijk geldt.

Gebruik een cuvet van 1 cm voor metingen bij lage micromolaire concentraties. Bij een epsilon van ongeveer 82,000 geeft 5 micromolar een absorbantie van ongeveer 0.41 en 10 micromolar ongeveer 0.82. Voor metingen gericht op het monomeer in water zonder toevoegingen is het veiliger om rond of onder ongeveer 5 tot 7 micromolar te blijven dan om te kalibreren tot ver in de tientallen micromolar. Verkort bij geconcentreerde voorraadoplossingen de weglengte in plaats van een absorbantie ver boven 1 te accepteren.

Gebruik als blanco exact dezelfde matrix: dezelfde waterkwaliteit, dezelfde fractie co-oplosmiddel, dezelfde buffer en zouten, maar zonder kleurstof. Bereid kalibratieoplossingen in diezelfde matrix bij dezelfde temperatuur. Scan tijdens de ontwikkeling het volledige zichtbare bereik, bij voorkeur ongeveer 550 tot 750 nm, in plaats van slechts één golflengte te meten. Volg de vorm, niet alleen de hoogte. Als seriële verdunning de genormaliseerde vorm verandert, is het systeem chemisch afhankelijk van de concentratie. Een stabiel maximum en een stabiele verhouding tussen 610 en 665 nm vormen sterker bewijs voor een aanvaardbaar bereik dan alleen een hoge R-kwadraatwaarde.

Documenteer de vorm van het reagens. Commercieel materiaal kan watervrij methylthioniniumchloride zijn of een hydraat, zoals het trihydraat. De molaire massa die voor berekeningen van voorraadoplossingen wordt gebruikt, moet dus overeenkomen met het materiaal in de daadwerkelijke fles. Deze stap alleen verklaart al een deel van de verschillen tussen nominale molaire concentraties van laboratoria. Dezelfde zorgvuldigheid is nodig wanneer resultaten worden gebruikt in berekeningen voor kwantitatieve bepalingen, wanneer spectra stabiliteitscontroles van formuleringen ondersteunen en wanneer onzuiverheidsprofielen een beoordeling van zuiverheid en specificaties vereisen.

Samenvatting met bijbehorende condities

Gebruik deze tabel als uitgangssjabloon voor een laboratoriumregistratie, niet als bron van onderling uitwisselbare constanten.

De absorptiegolflengte van methyleenblauw is dus een kort antwoord met een lange voetnoot. Rapporteer de piek die je hebt gemeten, in de oplossing die je hebt gemeten, bij de concentratie die je hebt gemeten. Die gewoonte voorkomt dat één waarde rond 664 nm voor een verdunde waterige oplossing verandert in een onterechte universele constante.