G6PD प्रयोगशाला परीक्षणमा मेथिलिन ब्लू: रञ्जकले वास्तवमा के गर्छ

एक विद्यार्थीले इन्क्युबेसनपछि दुईवटा ट्युब हेर्छन्। एउटाको रङ अपेक्षाअनुसार बदलिएको छ। अर्कोको बदलेको छैन। विद्यार्थीले दोस्रो बिरामीमा ग्लुकोज-6-फस्फेट डिहाइड्रोजनेजको कमी छ भन्ने निष्कर्ष निकाल्छन्। त्यो निष्कर्ष सही हुन सक्छ, तर त्यसको तर्कले परीक्षणलाई काम गराउने मूल अवधारणालाई छुटाउँछ। ट्युबमा कुनै पनि कुराले इन्जाइमलाई प्रत्यक्ष मापन गर्दैन। ट्युबले मेथिलिन ब्लूलाई मध्यस्थका रूपमा प्रयोग गरेर इन्जाइमले उत्पादन गर्ने पदार्थ मापन गर्छ।

यो अप्रत्यक्ष सम्बन्ध स्पष्ट भएपछि प्रक्रिया, नियन्त्रण नमुना र गलत नतिजाहरूको लामो सूची मनमानीजस्ता लाग्न छोड्छन्।

छोटो उत्तर

G6PD परीक्षणमा मेथिलिन ब्लू रेडक्स सूचक हो। G6PD इन्जाइमले NADPH उत्पादन गर्छ, र NADPH-निर्भर प्रणालीहरूले नीलो मेथिलिन ब्लूलाई यसको रङहीन ल्युको रूपमा अपचयन गर्छन् (वा इलेक्ट्रोन ओसार्न यसलाई प्रयोग गर्छन्)। इन्जाइमको सामान्य सक्रियताले प्रभावकारी अपचयन गराउँछ। न्यून सक्रियताले ढिलो वा अपूर्ण अपचयन गराउँछ। परीक्षणको सम्पूर्ण सङ्केत यही हो।

दुई ऐतिहासिक विधिमा एउटै रञ्जक प्रयोग हुन्छ, तर तिनका अन्तिम सूचक फरक छन्। यी दुईलाई छुट्टाछुट्टै बुझ्दा अधिकांश भ्रम हट्छ।

दुई परीक्षण, एउटै रञ्जक, फरक अन्तिम सूचक

पहिलो प्रत्यक्ष मेथिलिन ब्लू अपचयन परीक्षण हो, जसलाई Sass र सहकर्मीहरूले वर्णन गरेका थिए र पछि Gibbs ले मूल्याङ्कन गरेका थिए। यहाँ अन्तिम सूचक रञ्जक आफैँ हो: अक्सीकृत नीलो मेथिलिन ब्लू अपचयन हुँदै रङहीन ल्युकोमेथिलिन ब्लूतर्फ जान्छ, र त्यस परिवर्तनको दरले NADPH उत्पादन गर्ने क्षमता झल्काउँछ। प्रारम्भिक स्क्रिनिङसम्बन्धी शोधपत्र PubMed मा Sass र सहकर्मीहरू (1966) अन्तर्गत सूचीकृत छ।

दोस्रो Brewer मेथेमोग्लोबिन अपचयन परीक्षण हो। सोडियम नाइट्राइटले पहिले हेमोग्लोबिनलाई अक्सीकृत गरी खैरो मेथेमोग्लोबिन बनाउँछ। त्यसपछि मेथिलिन ब्लूले इलेक्ट्रोन स्थानान्तरणको मध्यस्थका रूपमा काम गर्छ: अपचयित मेथिलिन ब्लूले मेथेमोग्लोबिनलाई अपचायक समतुल्य प्रदान गरेर फेरि रातो हेमोग्लोबिनमा बदल्छ। त्यसैले देखिने अन्तिम सूचक खैरो र रातोबीचको भिन्नता हो, नीलो र रङहीनबीचको होइन। मूल विधि विश्व स्वास्थ्य सङ्गठनको बुलेटिनमा (Brewer र सहकर्मीहरू, 1960) प्रकाशित भएको थियो।

Brewer परीक्षणलाई रञ्जकको रङ हटाउने परीक्षण भन्नु रासायनिक दृष्टिले सटीक हुँदैन। रञ्जक चक्रमा फेरिँदै जान्छ; रङ बदलिने पदार्थ हेमोग्लोबिन हो। तलको चित्रले दुवै मार्ग देखाउँछ।

आधारभूत प्रतिक्रिया

G6PD ले पेन्टोज फस्फेट मार्गको पहिलो अक्सीकरण चरणलाई उत्प्रेरित गर्छ:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

परिपक्व रातो रक्तकोषहरू NADPH का लागि यस मार्गमा धेरै निर्भर हुन्छन्, जसको समीक्षा Blood मा Luzzatto र सहकर्मीहरूले (2020) गरेका छन्। NADPH ले ग्लुटाथायोनलाई अपचयित अवस्थामा राख्छ र कोषलाई अक्सीकरणजन्य क्षतिबाट जोगाउँछ। मेथिलिन ब्लू यस प्रणालीमा इलेक्ट्रोन ग्रहणकर्ताका रूपमा प्रवेश गर्छ। पर्याप्त G6PD ले पर्याप्त NADPH उपलब्ध गराउँछ, जसले प्रभावकारी अपचयन गराउँछ। न्यून G6PD ले यो शृङ्खलाको पहिलो कडीमै अवरोध ल्याउँछ।

रञ्जकलाई इन्जिन होइन, इन्धनको मात्रा देखाउने सूचकका रूपमा सोच्नुहोस्। यसले NADPH को आपूर्तिबारे जानकारी दिन्छ। त्यो आपूर्ति वा देखिने नतिजा बदल्ने अरू कुनै पनि कारकले जीनमा कुनै परिवर्तन नभए पनि सूचकलाई बदल्न सक्छ।

Brewer-प्रकारको प्रक्रिया कसरी चल्छ

दशकौँको अवधिमा अभिकर्मक मिश्रणका सूत्र फरक-फरक रहेका छन्, त्यसैले शिक्षणका लागि दिइएको विवरणलाई क्लिनिकल प्रोटोकल ठान्नु हुँदैन। प्रत्येक प्रयोगशालाले आफ्नै प्रमाणित मानक सञ्चालन प्रक्रिया पालना गर्छ। यो सावधानीलाई ध्यानमा राख्दा, परम्परागत ट्युब व्यवस्था तलको क्रमअनुसार चल्छ। तीनवटा ट्युब र 3 घण्टाको इन्क्युबेसनसहितको यो व्यवस्था यस प्रकाशित कार्यान्वयनमा अभिलेख गरिएको छ:

1. बिरामीको ट्युब: पूर्ण रगतमा ग्लुकोज, सोडियम नाइट्राइट र मेथिलिन ब्लू मिसाइन्छ। नाइट्राइटले मेथेमोग्लोबिन बनाउँछ, ग्लुकोजले रातो रक्तकोषको चयापचयलाई ऊर्जा दिन्छ, र रञ्जकले NADPH-निर्भर इलेक्ट्रोन ओसार्ने माध्यमको काम गर्छ।
2. अक्सीकृत नियन्त्रण: रगतमा नाइट्राइट र ग्लुकोज मिसाइन्छ, तर मेथिलिन ब्लू मिसाइँदैन। यसले खैरो मेथेमोग्लोबिनको अन्तिम अवस्था अर्थात् कमी भएको ढाँचा देखाउँछ।
3. हेमोग्लोबिन नियन्त्रण: रगतमा पानी मिसाइन्छ। यसले रातो हेमोग्लोबिनको अन्तिम अवस्था अर्थात् सामान्य ढाँचा देखाउँछ।
4. सबै ट्युबलाई हल्का चलाउँदै, सामान्यतया 3 घण्टासम्म करिब 37 C मा इन्क्युबेट गर्नुहोस्।
5. कोष फुटाउन र रङको तुलना स्पष्ट बनाउन प्रत्येक ट्युबको सानो अंशलाई आसुत पानीमा पातलो पार्नुहोस्।
6. बिरामीको ट्युबलाई दुई नियन्त्रण नमुनासँग तुलना गर्नुहोस्। रङ रातोतर्फ फर्कनुले पर्याप्त अपचायक क्षमता जनाउँछ। खैरो रङ रहिरहनुले उल्लेखनीय कमीको सङ्केत दिन्छ।

एउटा ऐतिहासिक मिश्रणमा करिब 1 mL रगतसँग लगभग 180 mM सोडियम नाइट्राइट, 280 mM डेक्स्ट्रोज र 0.4 mM मेथिलिन ब्लू भएका अभिकर्मक प्रयोग गरिएको थियो। यी सङ्ख्यालाई प्रकाशित साहित्यको उदाहरणका रूपमा लिनुहोस्, सार्वभौमिक मापदण्डका रूपमा होइन।

नतिजा बुझ्ने तरिका

गुणात्मक स्क्रिनिङले सामान्य सक्रियताको करिब 30 देखि 40 प्रतिशतको वरिपरि सबैभन्दा राम्रो भेद छुट्याउँछ, जसबारे G6PD पहिचानका कमीसम्बन्धी Malaria Journal को यस समीक्षामा चर्चा गरिएको छ। त्यसैले सामान्य स्क्रिनिङ नतिजाको अर्थ परीक्षणले गम्भीर कमी पत्ता लगाएन भन्ने हो। यसले सक्रियता पूर्ण रूपमा सामान्य छ भनेर प्रमाणित गर्दैन।

स्क्रिनिङ किन भ्रामक हुन सक्छ

हेमोलाइसिसपछि हुने रेटिकुलोसाइटोसिस सामान्य देखिने गलत नतिजाको परिचित कारण हो। नयाँ रातो रक्तकोष र रेटिकुलोसाइटमा पुराना कोषभन्दा बढी G6PD हुन्छ। तीव्र हेमोलाइसिसको घटनामा सबैभन्दा पुराना र सबैभन्दा बढी कमी भएका कोषहरू पहिल्यै नष्ट भइसकेका हुन सक्छन्, जसले गर्दा बाँकी नयाँ कोषहरूको सक्रियता परीक्षणमा सामान्य देखिन्छ। यही जैविक अवस्थाले रञ्जकमा आधारित स्क्रिनिङ मात्र होइन, परिमाणात्मक परीक्षणलाई पनि झुक्याउँछ।

हालै गरिएको रक्तसञ्चार ले कमी लुकाउँछ, किनकि दाताका रातो रक्तकोषले नमुनामा आफ्नै इन्जाइम थप्छन्। Mayo Clinic Laboratories ले रक्तसञ्चारलाई रेटिकुलोसाइटोसिस र श्वेत रक्तकोषको हस्तक्षेपसँगै अविश्वसनीय इन्जाइम नतिजाका कारणमा सूचीकृत गरेको छ।

हेटेरोजाइगस महिलाहरू को अवस्था छुट्याउन सबैभन्दा कठिन हुन्छ। X-क्रोमोसोमको अनियमित निष्क्रियताले सामान्य र कमी भएका रातो रक्तकोषको मिश्रण बनाउँछ, र समग्र सक्रियता गम्भीर रूपमा कमदेखि सामान्य देखिनेसम्म जुनसुकै स्तरमा हुन सक्छ। गुणात्मक स्क्रिनिङले प्रायः मध्यवर्ती फेनोटाइप छुटाउँछ। G6PD परीक्षणसम्बन्धी WHO को दस्तावेजमा यस सीमितताबारे विस्तृत चर्चा गरिएको छ।

नमुना कति पुरानो छ, भण्डारणको तापक्रम, आँखाले अन्तिम रङ छुट्याउँदा हुने व्यक्तिपरकता, हेमाटोक्रिट र अभिकर्मकको गुणस्तरले यी जैविक प्रभावसँगै विश्लेषणमा थप अनिश्चितता ल्याउँछन्।

स्क्रिनिङ नै निदान होइन

कमी भएको, मध्यवर्ती वा क्लिनिकल अवस्थासँग नमिल्ने स्क्रिनिङ नतिजामा परिमाणात्मक G6PD इन्जाइम परीक्षण आवश्यक हुन्छ। WHO ले तापक्रम-नियन्त्रित परिमाणात्मक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रीलाई सन्दर्भ विधि मान्छ। त्यस परीक्षणमा रातो रक्तकोषको हेमोलाइसेटमा ग्लुकोज-6-फस्फेट र NADP+ थपिन्छ, र उत्पादन हुने NADPH लाई 340 nm मा बढ्दो अवशोषणका आधारमा मापन गरिन्छ। परिवर्तनको दर इन्जाइमको सक्रियतासँग समानुपातिक हुन्छ, र यसलाई सामान्यतया प्रति ग्राम हेमोग्लोबिनका एकाइमा मानकीकृत गरिन्छ। हालको क्लिनिकल प्रयोगशाला अभ्यासको सारांश G6PD सक्रियतासम्बन्धी Mayo परीक्षण सूचीको विवरणमा दिइएको छ।

नतिजाको व्याख्यामा प्रयोगशालाले प्रमाणित गरेको सन्दर्भ दायरा प्रयोग गरिन्छ, जुन प्रायः जनसङ्ख्याको सामान्य सक्रियताको सापेक्षमा निर्धारण गरिएको हुन्छ। कमीबारे सामान्यतया 30 प्रतिशतको सीमाको आसपास र मध्यवर्ती सक्रियताबारे त्यसभन्दा माथि चर्चा गरिन्छ। G6PD परीक्षणका लागि WHO का लक्षित उत्पादन प्रोफाइलहरू (2022) ले यो निदानसम्बन्धी ढाँचा प्रस्तुत गर्छन्। हालैको हेमोलाइसिस वा रक्तसञ्चारले फेनोटाइप निर्धारणलाई अविश्वसनीय बनाएको छ भने रातो रक्तकोषको समूह फेरि सन्तुलित भएपछि परीक्षण दोहोर्‍याउनुहोस्। आणविक परीक्षणले थप जानकारी दिन सक्छ, तर इन्जाइमको मापनलाई प्रतिस्थापन गर्दैन।

कायम राख्नुपर्ने भिन्नता

यी परीक्षणमा मेथिलिन ब्लू शरीरबाहिर प्रयोग गरिने प्रयोगशाला अभिकर्मक हो। यो तथ्य बिरामीलाई मेथिलिन ब्लू दिँदाको सुरक्षासम्बन्धी छलफलभन्दा अलग हो, जसलाई मेथिलिन ब्लू प्रयोग नगर्नुपर्ने अवस्थासम्बन्धी मार्गदर्शनमा समेटिएको छ। जैवरसायनले यी दुईलाई जोड्छ, किनकि औषधि पनि NADPH-निर्भर अपचयनमा निर्भर हुन्छ, तर परीक्षण ट्युबमा भएको रञ्जक र रक्तप्रवाहमा दिइएको मात्रा एउटै कुरा होइनन्। फरक परिवेशमा यो रञ्जकले अभिरञ्जकका रूपमा कसरी काम गर्छ भन्ने सन्दर्भका लागि मेथिलिन ब्लू अभिरञ्जनका सिद्धान्तहरू हेर्नुहोस्, र यो पर्ने रासायनिक परिवारबारे बुझ्न प्रयोगशालामा प्रयोग हुने रेडक्स रञ्जकहरू हेर्नुहोस्।

स्क्रिनिङले अपचायक क्षमता कायम रहेको देखिन्छ कि देखिँदैन भन्ने प्रश्न सोध्छ। पुष्टिकरणले वास्तवमा इन्जाइम कति छ भन्ने प्रश्न सोध्छ। रञ्जकले पहिलो प्रश्नको राम्रो उत्तर दिन्छ, तर त्यसलाई दोस्रो प्रश्नको उत्तर दिन लगाउनु हुँदैन।