बायोफिल्मविरुद्ध मेथिलिन ब्लू: प्रकाशबाट सक्रिय गरिने प्रयोगशाला अध्ययनहरूले के मापन गर्छन्

बायोफिल्म तरलमा तैरिरहेका कोषहरूको भीड होइन। यो एउटा संरचना हो: सतहमा टाँसिएका कोषहरू, तिनले आफैँ बनाएको पोलिस्याकेराइड, प्रोटिन र कोषबाह्य DNA को आधार-जालमा समाहित हुन्छन्, र बाहिरदेखि भित्रसम्म अक्सिजन तथा पोषक तत्त्वको मात्रा क्रमशः फरक हुन्छ। यही संरचनाका कारण तरलमा निलम्बित ब्याक्टेरियालाई केही मिनेटमै मार्ने यौगिकले बायोफिल्मका रूपमा हुर्काइएका उही जीवहरूविरुद्ध काम नगर्न सक्छ। मेथिलिन ब्लू र बायोफिल्मबारे कुनै पनि दाबी यही संरचनालाई ध्यानमा राखेर पढ्नुपर्छ, किनभने कति रङ कोषहरूसम्म पुग्छ र कति प्रकाश रङसम्म पुग्छ भन्ने कुरा आधार-जालले निर्धारण गर्छ।

यो समीक्षाले ठ्याक्कै तीन स्रोत समेट्छ। एउटा पृष्ठभूमिका लागि हो। दुईवटा प्रयोगशालाका प्रयोग हुन्। ती भूमिकालाई अलग राख्नु नै यहाँको सम्पूर्ण विधि हो। यसले यस विषयको सबैभन्दा सामान्य गल्ती रोक्छ: प्रयोगशालाको पात्रमा प्राप्त नतिजालाई मानिसको सङ्क्रमण उपचारको प्रमाणसरह प्रस्तुत गर्नु।

पृष्ठभूमिको स्रोत रसायनशास्त्रबारे हो, जीव मार्ने प्रभावबारे होइन

यी तीनमध्ये सबैभन्दा पुरानो स्रोत 2005 मा प्रकाशित फेनोथियाजिनियम प्रकाशसंवेदीकारक विकासको वर्णनात्मक समीक्षा हो। यसले मेथिलिन ब्लूको यात्रा 19 औँ शताब्दीको रङदेखि क्यान्सरको प्रकाशगतिक उपचार र पछि प्रकाशगतिक सूक्ष्मजीवरोधी रासायनिक उपचारका लागि प्रमुख यौगिकसम्म पछ्याउँछ। यसको योगदान संरचना र क्रियाशीलताबीचको सम्बन्धको विवरण हो: क्रोमोफोरको मिथाइलीकरणले बोसोमा घुल्ने प्रवृत्ति, सिंग्लेट अक्सिजनको उत्पादन र प्रकाशद्वारा ब्याक्टेरिया मार्ने क्षमता बढाउँछ, साथै कम सक्रिय ल्युको रूपमा अपचयन हुने प्रक्रियालाई सुस्त बनाउँछ। यसले यस क्षेत्रको समस्या पनि स्पष्टसँग बताउँछ। अधिकांश प्रतिवेदनले मानक व्यावसायिक रङ प्रयोग गरेका थिए, र तिनका व्युत्पन्न यौगिकको विकास तुलनात्मक रूपमा निकै कम भएको थियो।

आफ्नो बुझाइको कार्यविधि खण्डका लागि यो समीक्षा प्रयोग गर्नुहोस्: प्रकाशले रङलाई उत्तेजित गर्छ, ट्रिप्लेट अवस्थाले Type II ऊर्जा स्थानान्तरणमार्फत अक्सिजनसँग क्रिया गरी सिंग्लेट अक्सिजन बनाउँछ, वा Type I इलेक्ट्रोन स्थानान्तरणमार्फत रेडिकल बनाउँछ। यही बहुकारकीय आक्रमणका कारण परम्परागत प्रतिरोधका संयन्त्रहरू प्रकाशगतिक प्रक्रियाबाट जीव मारिने अवस्थामा खासै लागू हुँदैनन्। लगरिद्मिक कमीको प्रमाणका लागि यसलाई उद्धृत नगर्नुहोस्। यसले त्यस्तो कुनै कमी मापन गरेको थिएन। यस कार्यविधिको पछाडिको व्यापक प्रकाशरसायनशास्त्र प्रकाशगतिक उपचारको प्रमाण सङ्ग्रहमा प्रस्तुत गरिएको छ। कुनै निश्चित बत्तीले यो प्रक्रिया चलाउन सक्छ कि सक्दैन भन्ने निर्धारण गर्ने तरङ्गदैर्ध्यका नियमहरू मेथिलिन ब्लूले रातो प्रकाश कसरी अवशोषण गर्छ भन्ने लेखमा समेटिएका छन्।

बायोफिल्मका दुई प्रयोग, परिणाम मापनका दुई फरक अवधारणा

दुवै प्रयोगात्मक शोधपत्रले मुखका बायोफिल्ममा 660 nm मा मेथिलिन ब्लूको प्रकाशगतिक क्रिया परीक्षण गर्छन्, तर लगभग अरू कुनै कुरामा समान छैनन्। सूक्ष्मजीव समुदाय, उमेर, रङको मिश्रण, प्रकाशको मात्रा र सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण रूपमा मापनका अन्तिम सूचक फरक छन्। यही भिन्नता यस लेखको मुख्य विषय हो, र तलको मौलिक तुलनात्मक सामग्रीको आधार पनि यही हो।

पहिलो स्रोत 2024 मा प्रकाशित परिपक्व, बहुप्रजातीय गिजामुनिको बायोफिल्मको इन भिट्रो अध्ययन हो। Calgary Biofilm Device मा पोलिस्टाइरिनका पिनमाथि तेत्तीस प्रजातिलाई सँगै हुर्काइयो। अक्सिजनरहित अवस्थामा पोषण दिइयो, 72 घण्टापछि संवर्धन माध्यम फेरियो र निर्धारित 7 दिनसम्म वृद्धि जारी राखियो। परीक्षणमा 0.01 प्रतिशत मुक्त मेथिलिन ब्लू र 660 nm को रातो LED प्रयोग गरियो। LED को विकिरण तीव्रता करिब 330 mW प्रति वर्ग cm थियो, दूरी 2 mm र प्रकाश दिने अवधि 5 मिनेट थियो। यसलाई गुणन गर्दा करिब 99 J प्रति वर्ग cm हुन्छ। प्रयोगको डिजाइन चार समूह भएको स्पष्ट कारकीय डिजाइन हो: उपचार नगरिएको नियन्त्रण, प्रकाशबिनाको रङ, रङबिनाको प्रकाश र रङसहित प्रकाश।

दोस्रो स्रोत 2021 मा प्रकाशित प्रारम्भिक रूपमा बसोबास गर्ने मुखको बायोफिल्मको इन भिट्रो अध्ययन हो। चार Streptococcus प्रजातिलाई 1 प्रतिशत सुक्रोजसहित 96 खोपिल्टा भएका प्लेटमा 24 घण्टासम्म सँगै हुर्काइयो। प्रकाशसंवेदीकारक 4.65 माइक्रोमोलर सांद्रतामा बिटा साइक्लोडेक्स्ट्रिन न्यानोकणसँग जोडिएको मेथिलिन ब्लू थियो। यो बायोफिल्मका अवरोध पार गरेर रङ पुर्‍याउने उद्देश्यको मिश्रण थियो। दुवै प्रकाश स्रोत 660 nm को रातो प्रकाश थिए र प्रत्येकले 90 सेकेन्डसम्म प्रकाश दिए, तर प्रकाशका मात्रामा ठूलो भिन्नता थियो: लेजर समूहमा 320 J प्रति वर्ग cm र LED समूहमा 8.1 J प्रति वर्ग cm। नियन्त्रण समूहमा प्रकाशबिनाको रङ, लेजर मात्र, LED मात्र, नकारात्मक नियन्त्रणका रूपमा नुनिलो घोल र सूक्ष्मजीवरोधी तुलना-मानकका रूपमा 0.2 प्रतिशत क्लोरहेक्सिडिन समावेश थिए।

7 दिन पुरानो, 33 प्रजातिको अक्सिजनरहित समुदाय र 24 घण्टा पुरानो, 4 प्रजातिको प्रारम्भिक बसोबासी बायोफिल्म फरक मापन प्रणाली हुन्। तलका सङ्ख्याहरूको औसत निकाल्न मिल्दैन।

प्रत्येक अध्ययनले वास्तवमा के मापन गर्‍यो

परिपक्व बायोफिल्म अध्ययनमा मापनका अन्तिम सूचकहरू 485 nm मा पढिएको TTC अपचयनबाट चयापचय गतिविधि र 33 प्रजातिका लागि प्रोबहरू प्रयोग गरिएको चेकरबोर्ड DNA–DNA हाइब्रिडाइजेसनबाट ब्याक्टेरियाको मात्रा थिए। पत्ता लगाउने सीमा करिब 10,000 कोष थियो। जीवित सूक्ष्मजीव गन्न प्लेटमा संवर्धन गरिएको थिएन, क्रिस्टल भायोलेटबाट जैवद्रव्यमान मापन गरिएको थिएन, जीवित र मृत कोषको चित्रण गरिएको थिएन र पुनःवृद्धिको अनुगमन पनि थिएन। LED मात्रले LED नपाएका समूहको तुलनामा चयापचय गतिविधि करिब 50 प्रतिशत घटायो, र रङसहित LED ले करिब 55 प्रतिशत घटायो। रङ मात्र पाएको समूह तथ्याङ्कीय रूपमा उपचार नगरिएको नियन्त्रणकै समूहमा पर्‍यो। DNA बाट प्राप्त गणनामा रङ मात्र, LED मात्र र रङसहित LED तीनै समूह नियन्त्रणभन्दा उल्लेखनीय रूपमा तल थिए, तर ती तीनबीच उल्लेखनीय भिन्नता थिएन। लेखकहरूले यसको निष्कर्ष स्पष्ट रूपमा बताएका छन्: यी प्रयोगहरूले स्थापित, सतहमा टाँसिएको बहुसूक्ष्मजीवी बायोफिल्म नष्ट गरेनन्, र परिपक्व पेरियोडोन्टल बायोफिल्मको संरचना यान्त्रिक रूपमा भङ्ग गर्नुपर्छ; प्रकाशगतिक प्रक्रिया बढीमा सहायक उपाय हुन सक्छ।

प्रारम्भिक बसोबासीको अध्ययनमा मापनको अन्तिम सूचक चयनात्मक संवर्धन माध्यममा प्राप्त जीवित सूक्ष्मजीव थिए, जसलाई लगरिद्मिक मापनक्रममा व्यक्त गरिएको थियो। प्रकाशबिनाको रङ समूह नुनिलो घोल समूहभन्दा फरक थिएन। दुवै प्रकाशसक्रिय समूह, लेजरसहित क्याप्सुलभित्रको रङ र LED सहित क्याप्सुलभित्रको रङले, नकारात्मक नियन्त्रणको तुलनामा जीवित सूक्ष्मजीवको गणना करिब 4 log सम्म घटाए। यस मापनमा यो 10,000 गुणा वा 99.99 प्रतिशत कमी हो, र कुनै पनि समूह क्लोरहेक्सिडिनभन्दा तथ्याङ्कीय रूपमा फरक थिएन। प्रकाश मात्र र प्रकाशबिनाका अवस्थाका मानहरू छुट्टाछुट्टै भरपर्दा log सङ्ख्याका रूपमा प्रतिवेदनमा दिइएका थिएनन्। त्यसैले इमानदार सारांश शोधपत्रले समर्थन गरेको यही हो: प्रकाशबाट सक्रिय गरिएको क्याप्सुलभित्रको रङले कमी ल्यायो, प्रकाशबिनाको रङले ल्याएन, र यस नयाँ बायोफिल्म मोडेलमा कमीको परिमाण एन्टिसेप्टिक तुलना-मानकसँग मिल्दोजुल्दो थियो।

कुनै पनि शोधपत्रले परीक्षणपछि पुनःवृद्धि, बाँकी जैवद्रव्यमान वा आधार-जालको संरचना मापन गरेन। CFU मा आएको कमीले बाँकी आधार-जालबारे केही बताउँदैन। चयापचयमा आएको कमीले बाँचिरहेका सूक्ष्मजीवबारे केही बताउँदैन। DNA गणनाले कुन जीव जीवित छ भन्न सक्दैन।

परीक्षण विधि र अन्तिम मापन सूचकको तुलना

यो तालिका यस लेखको तुलनात्मक सामग्री हो। एउटा अध्ययनले के प्रमाणित गर्छ भन्ने बुझ्न पङ्क्तिमा दायाँतिर पढ्नुहोस्, र कुन प्रश्नको उत्तर कुनै पनि अध्ययनले दिँदैन भन्ने बुझ्न स्तम्भमा तलतिर पढ्नुहोस्।

तीन भिन्नतामा जोड दिन आवश्यक छ। पहिलो, परिपक्व मोडेलमा प्रकाश मात्रको समूहले लगभग सम्पूर्ण चयापचय प्रभावको व्याख्या गर्छ, त्यसैले 55 प्रतिशतको आँकडा रङको माध्यमबाट जीव मारिएको मापन होइन। दोस्रो, नयाँ मोडेलमा प्रकाशबिनाको मिश्रण निष्क्रिय छ र प्रभाव प्रकाश हुँदा मात्र देखिन्छ, जुन प्रकाशसक्रियताको विशिष्ट सङ्केत हो। तेस्रो, DNA बाट प्राप्त गणनामा 80 प्रतिशतको कमी गणितीय रूपमा करिब 0.7 log हुन्छ, तर त्यो चर जीवित सूक्ष्मजीवको गणना भएको अवस्थामा मात्र। यहाँ त्यस्तो होइन, त्यसैले यसलाई लगरिद्मिक जीव-हत्याको मापनका रूपमा कहिल्यै उद्धृत गर्नु हुँदैन। दाँतको बायोफिल्मसँग सम्बन्धित सन्दर्भ मुखको बायोफिल्म र दन्त अनुसन्धानमा सङ्कलित छ। विभिन्न अध्ययनका मोडेल, प्रयोगका मार्ग र अन्तिम मापन सूचकलाई छुट्याउने सामान्य विधि प्रयोगशाला विधि मार्गदर्शिका मा विस्तारपूर्वक दिइएको छ।

बायोफिल्म अध्ययन पढ्न छुट्टै नियम किन चाहिन्छ

मेथिलिन ब्लूको बायोफिल्म नतिजाको अर्थ त्यसको आफ्नै प्लेटभन्दा बाहिर पनि छ कि छैन भन्ने चार चरले निर्धारण गर्छन्।

पहिलो, बायोफिल्मको उमेर र आधार-जाल। पुराना बायोफिल्म बाक्ला हुन्छन्, तिनमा अन्तरसम्बन्ध बढी हुन्छ र रङलाई भित्र छिर्न कठिन हुन्छ। 2021 का लेखकहरूले व्यवस्थित बायोफिल्मभित्र रङको प्रवेश र प्रकाशको कमजोर प्रसारलाई मुख्य सीमाका रूपमा उल्लेख गरेका छन्। साइक्लोडेक्स्ट्रिनमा क्याप्सुलबद्ध गर्ने जस्ता वाहक रणनीतिहरूले यही सीमालाई सम्बोधन गर्ने प्रयास गर्छन्। त्यसैले मिश्रणको स्वरूप एउटा प्रयोगात्मक चर हो, सामान्य विवरण मात्र होइन।

दोस्रो, मात्राको गणना। यहाँ उही तरङ्गदैर्ध्यमा फ्लुएन्सका मानहरू 8.1 देखि 320 J प्रति वर्ग cm सम्म, लगभग चालीस गुणा फैलिएका छन्, र विकिरण तीव्रता 90 mW देखि धेरै W प्रति वर्ग cm सम्म छ। उही तरङ्गदैर्ध्यको अर्थ उही प्रकाश सम्पर्क होइन, र कुनै पनि अध्ययनले मात्रा र प्रभावको वक्र निर्धारण गर्न पर्याप्त व्यवस्थित रूपमा मात्रा परिवर्तन गरेको छैन।

तेस्रो, नियन्त्रण समूह। प्रकाशबिनाको रङ समूह नभएको अध्ययनले रङको अन्तर्निहित विषाक्ततालाई कारणबाट हटाउन सक्दैन, र प्रकाश मात्रको समूह नभएको अध्ययनले कुनै प्रभावलाई प्रकाशसक्रियताका कारण भएको भन्न सक्दैन। दुवै शोधपत्रमा दुवै नियन्त्रण छन्, जुन तिनको राम्रो पक्ष हो। परिपक्व बायोफिल्मको शोधपत्रले प्रकाश मात्रको समूह किन महत्त्वपूर्ण छ भन्ने देखाउँछ: त्यो नभएको भए चयापचयको नतिजालाई रङको प्रभावका रूपमा बुझिन्थ्यो।

चौथो, अन्तिम मापन सूचक। जीवितता, चयापचय, DNA को मात्रा, जैवद्रव्यमान, संरचना र पुनःवृद्धि छवटा फरक दाबी हुन्। यहाँ कुनै पनि शोधपत्रले दुईभन्दा बढी मापन गरेको छैन। विशेषगरी पुनःवृद्धिको मापन सबैमा अनुपस्थित छ, त्यसैले प्रभावको निरन्तरता प्रमाणित भएको होइन, मापन नै नभएको हो।

यसले सङ्क्रमणको उपचारबारे के स्थापित गर्दैन

यी कुनै पनि प्रयोगात्मक व्यवस्थामा रक्तसञ्चार, प्रतिरक्षा कोष, लारको प्रवाह, गिजाको खाँचोको तरलको आदानप्रदान वा यान्त्रिक सफाइ समावेश छैन। प्लेटको खोपिल्टामा भएको रङको सांद्रता मानिसमा कुनै पनि मार्गबाट प्रयोग गरेपछि तन्तुमा पुग्ने सांद्रता होइन। नयाँ वा परिपक्व प्रयोगशाला बायोफिल्मलाई एकपटक 5 मिनेट वा 90 सेकेन्ड प्रकाश दिनु उपचारको पूरा क्रम होइन। परिपक्व बायोफिल्मका लेखकहरूले प्रकाशगतिक प्रक्रियालाई आफैँमा पूर्ण उन्मूलन विधि नभई यान्त्रिक हटाउने प्रक्रियाको सम्भावित सहायकका रूपमा प्रस्तुत गरेर यही कुरा बताएका छन्।

सही सारांश सीमित र टिकाउ छ। प्रकाशबाट सक्रिय गरिएको मेथिलिन ब्लूले प्रयोगशालामा हुर्काइएको परिपक्व मुखको सूक्ष्मजीव समुदाय नष्ट नगरी त्यसको चयापचय र DNA बाट अनुमानित मात्रा घटाउन सक्छ। त्यस व्यवस्थामा चयापचयमाथिको अधिकांश प्रभाव प्रकाश मात्रले उत्पन्न गरेको थियो। प्रकाशबाट सक्रिय गरिएको, साइक्लोडेक्स्ट्रिनले बोकेको रङले प्रयोगशालामा हुर्काइएको नयाँ स्ट्रेप्टोकोकल बायोफिल्ममा जीवित सूक्ष्मजीवको गणना धेरै लगरिद्मिक तहसम्म घटाउन सक्छ, र यो कमी उही मोडेलमा क्लोरहेक्सिडिनसँग तुलना गर्न मिल्ने स्तरको हुन्छ। यीमध्ये कुनै पनि अवलोकन मानिसको सङ्क्रमणमा लागू हुन्छ कि हुँदैन भन्ने कुरा रङको वितरण, प्रकाशको पहुँच, अक्सिजन, शरीरको संरचना र चिकित्सकीय अन्तिम मापन सूचकमा निर्भर हुन्छ। यी प्रयोगहरू ती कुरा मापन गर्न डिजाइन गरिएका थिएनन्।