मेथिलिन ब्लु यीस्ट परीक्षण: जीवित कोष गन्ने कि श्वसनको समय मापन गर्ने

प्रयोगशालाको मेचमा दुईवटा नली छन्। दुवै नीला छन्। एउटामा सूक्ष्मदर्शकले देखिने नीला कोषको अर्थ मृत यीस्ट हो। अर्कोमा नली नीलोबाट रङहीन हुनुको अर्थ यीस्ट जीवित छ र श्वसन गरिरहेको छ। रञ्जक एउटै, तर नतिजाको अर्थ विपरीत। यी दुई परीक्षणलाई झुक्किएमा हरेक निष्कर्ष उल्टिन्छ।

यो भिन्नता नै यस लेखको मुख्य विषय हो। मेथिलिन ब्लु एउटा रेडक्स रञ्जक हो: अक्सीकरण भएको अवस्थामा यो नीलो हुन्छ, अपचयन भएपछि रङहीन ल्युकोमेथिलिन ब्लु हुन्छ। जीवितता गणनाले यो रसायनलाई सूक्ष्मदर्शकमा छोटो समयको अवलोकनका लागि प्रयोग गर्छ। श्वसन प्रयोगले यसलाई सम्पूर्ण मिश्रणमा हुने प्रतिक्रियाको समय मापन गर्न प्रयोग गर्छ। प्रत्येकका लागि छुट्टै विधि, छुट्टै नियन्त्रण र आफ्नै सतर्क मूल्याङ्कन आवश्यक हुन्छ।

जीवितता गणना: छोटो समय रञ्जन गर्ने, तुरुन्तै पढ्ने

बियर उत्पादनमा प्रयोग हुने विधि यसको सबैभन्दा मानकीकृत रूप हो। 2% सोडियम साइट्रेटमा 0.01% w/v मेथिलिन ब्लु तयार गर्नुहोस्, यसलाई यीस्ट निलम्बनसँग 1:1 अनुपातमा मिसाउनुहोस् र छोटो, निश्चित अन्तरालपछि मिश्रण जाँच्नुहोस्। प्रकाशित अन्तरालहरू Brewing Science Institute को पुस्तिका मा 1 देखि 2 मिनेटदेखि अनुसन्धान विधिहरूमा करिब 5 मिनेटसम्म छन्। OIV को वाइन सूक्ष्मजीवविज्ञान विधि ले भने 10 मिनेटभित्र जाँच गर्नुपर्ने बताउँछ। गणना मिश्रणमा रञ्जकको अन्तिम सान्द्रता करिब 0.005% हुन्छ। सुधारिएको Neubauer गणना कक्षमा मिश्रण राख्नुहोस् र करिब 400x मा गाढा नीला कोषलाई अजीवित र रङ नलागेका कोषलाई जीवित वर्गमा राख्नुहोस्। OIV विधिमा हल्का नीला कोषलाई जीवित मानिन्छ, जसले तल चर्चा गरिएको व्यक्तिपरकताको समस्यातर्फ सङ्केत गर्छ।

कोषको सान्द्रता गणना कक्षको ज्यामितिबाट निकालिन्छ। बीचको पूरा 1 mm वर्ग गन्दा, प्रति mL कोष सङ्ख्या N गुणा तनुकरण गुणक गुणा 10^4 हुन्छ, जहाँ N त्यस क्षेत्रभित्रको गणना हो। यो ASBC का यीस्ट विधिहरू मा उल्लेख गरिएको छ। जीवितताको गणना अझ सरल छ: रङ नलागेका कोषलाई कुल कोषले भाग गरेर 100 ले गुणा गर्ने। FEMS को बियर उत्पादनसम्बन्धी तुलनात्मक अध्ययन र OIV को अभ्यासअनुसार जीवितताको अनुमानका लागि करिब 400 कोष गन्नुहोस्। सीमारेखासम्बन्धी एउटै नियम निरन्तर लागू गर्नुहोस्; उदाहरणका लागि, तल्लो र बायाँ जालीरेखामा पर्ने कोष समावेश गर्ने र माथिल्लो तथा दायाँ रेखामा पर्ने कोष नसमेट्ने।

गणना सुरु गर्नुअघि कोपिलाका लागि नियम तय गर्नुपर्छ। एउटा प्रचलित नियमअनुसार कोपिला मातृकोषको करिब आधा आकार पुगेपछि छुट्टै कोषका रूपमा गनिन्छ, र त्यसभन्दा सानो हुँदा मातृकोषसँगै गनिन्छ। जुन नियम रोजे पनि प्रत्येक वर्गमा लागू गर्नुहोस् र कार्यपत्रमा लेख्नुहोस्, ताकि अर्को व्यक्तिले पनि उही तरिका अपनाओस्।

गणना कार्यपत्र (यसलाई छाप्नुहोस्)

यो कार्यपत्र यस लेखका लागि तयार गरिएको मौलिक सामग्री हो। यसलाई नोटबुकमा सार्नुहोस् वा प्रत्येक नमुनाका लागि एउटा छाप्नुहोस्।

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, जहाँ N तोकिएको गणना कक्ष क्षेत्रबाट प्राप्त हुन्छ। नतिजासँगै रञ्जन अन्तराल पनि लेख्नुहोस्, किनकि समय उल्लेख नभएको जीवितताको अङ्क पुनरुत्पादन गर्न सकिँदैन।

जीवितताका अङ्क किन फेरिन्छन्

समय पहिलो हस्तक्षेप हो, र यसको असर दुवैतर्फ पर्छ। चयापचयमा सक्रिय कोषले रञ्जकको अपचयन गर्छन्। त्यसैले चाँडै पढ्दा जीवित कोषले अपचयन पूरा गरिनसकेको अवस्थामा तिनलाई मृत भनेर गलत वर्गीकरण गर्न सकिन्छ। तर लामो समयसम्मको सम्पर्क आफैँ विषाक्त हुन्छ र साँच्चै क्षतिग्रस्त नीला कोष उत्पन्न गर्छ, जसले मृत कोषको रञ्जन भएको भ्रामक नतिजा दिन्छ। त्यसैले प्रयोगशालाको शिक्षण विधिले 5 मिनेटभित्र मूल्याङ्कन गर्न निर्देश गर्छ, जसको विवरण विस्कन्सिनको यीस्ट शिक्षण विधि मा छ। सुरक्षित निष्कर्ष के हो भने मेथिलिन ब्लुको मूल्याङ्कन समयनिर्भर हुन्छ। त्यसैले एउटा छोटो अन्तराल तय गर्नुहोस् र शृङ्खलाका हरेक नमुनामा त्यसलाई उस्तै राख्नुहोस्।

कम जीवितता भएका नमुनामा दोस्रो प्रकारको पक्षपात हुन्छ। मानकीकृत विधिले करिब 80% भन्दा कम जीवितता हुँदा मेथिलिन ब्लुले वास्तविक जीवितता बढी देखाउन सक्ने चेतावनी दिन्छ, किनकि अझै रञ्जकको अपचयन गर्न सक्ने कोषमा प्रजनन क्षमता कायम नहुन पनि सक्छ। बियर उत्पादनसम्बन्धी साहित्यले पनि जीवितता निकै घटेको अवस्थामा यही अविश्वसनीयता वर्णन गर्छ। मेथिलिन ब्लुलाई छिटो प्राप्त हुने मोटामोटी अनुमानका रूपमा लिनुहोस्। कम जीविततासँग सम्बन्धित महत्त्वपूर्ण निर्णयहरू, जस्तै यीस्ट संवर्धनलाई फेरि बियर उत्पादनमा प्रयोग गर्ने निर्णय, प्लेट गणना वा पूरक रञ्जनद्वारा पुष्टि गर्नुहोस्।

तेस्रो असर नमुनाको म्याट्रिक्सबाट आउँछ। OIV विधि करिब pH 4.6 मा चलाइन्छ र बलियो बफर क्षमता भएका कम pH का नमुनाले रञ्जकलाई सही व्यवहार गर्न नदिने चेतावनी दिन्छ। साथै, चिनी 100 g/L भन्दा बढी हुँदा कोष भ्रामक रूपमा हल्का नीला देखिने भएकाले यो परीक्षण नगर्न सल्लाह दिन्छ। रञ्जनको pH सम्बन्धी प्रयोगात्मक तुलनाले परीक्षण गरिएको दायराभर संवेदनशीलतामा उल्लेखनीय परिवर्तन पायो, जुन pH मा निर्भर मेथिलिन ब्लु विधिको अध्ययन सँग मेल खान्छ। अवशेष अर्को छुट्टै समस्या हो: अशुद्ध अन्न-मिश्रणमा रङ लागेका कण मृत कोषजस्ता देखिन्छन् र परीक्षण गर्ने व्यक्तिहरूबीचको नतिजा भिन्नता बढाउँछन्।

यो भिन्नता अनुभवमा मात्र आधारित छैन, मापन गरिएको छ। FEMS को यीस्ट तुलना मा प्रस्तुत छ महिनाको बियर उत्पादन परीक्षणमा, मेथिलिन ब्लुका दोहोरो मापनको औसत मानक विचलन 6.1% थियो भने अक्सोनोल फ्लो साइटोमेट्रीको 0.2% थियो। एउटै नमुनामा दुई परीक्षणकर्ताको नतिजा 13 प्रतिशत बिन्दुसम्म फरक थियो। जीवितता विधिहरूको 2023 को परिमाणात्मक तुलना ले प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शन र फ्लो साइटोमेट्री उल्लेखनीय रूपमा बढी परिशुद्ध भएको पायो, साथै कार्यसम्पादन प्रजाति र नमुना म्याट्रिक्समा निर्भर हुने देखायो। पेन्टिङ र किर्सोप (PMID 24430080) को शास्त्रीय विधि विवरण अझै मुख्य सन्दर्भ हो। यीस्टको जीवितता र जैविक सक्रियता परीक्षणहरूको विस्तृत समीक्षा (PMID 25154541) ले मेथिलिन ब्लुलाई निर्णायकभन्दा पूरक परीक्षणको रूपमा राख्छ। यहाँ ट्राइपान ब्लु स्वतः राम्रो विकल्प हुँदैन: यसले झिल्लीको अखण्डता गुमेको देखाउँछ भने मेथिलिन ब्लुले कोषभित्र रञ्जकको प्रवेश र अपचयन गतिविधि देखाउँछ। त्यसैले तनावमा परेका कोष यी दुई रञ्जकमा फरक वर्गमा पर्न सक्छन्।

श्वसन प्रयोग: नीलो रङ हराउन लाग्ने समय मापन गर्ने

दोस्रो परीक्षणमा सूक्ष्मदर्शकबाट हेरिँदैन। यीस्ट, ग्लुकोज र पातलो मेथिलिन ब्लु घोल बन्द नलीमा राखिन्छ, अनि नीलो रङ हराउन कति समय लाग्छ भन्ने घडीले मापन गर्छ। कोषले चयापचय गर्दा अपचयनकारी समतुल्यहरू उत्पन्न हुन्छन्, जसले नीलो रञ्जकलाई रङहीन रूपमा बदल्छन्। घुलित अक्सिजनले भने यसलाई फेरि अक्सीकरण गर्छ। कोषले अक्सिजनको मात्रा घटाएपछि समग्रमा अपचयन हावी हुन्छ र नली रङहीन बन्छ। त्यसैले अन्तिम बिन्दुले श्वसन, रञ्जकको सान्द्रता र अक्सिजनको उपलब्धताबीचको सन्तुलन देखाउँछ। यसलाई मेथिलिन ब्लुको अपचयन वा रङहीन हुन लाग्ने समयका रूपमा रिपोर्ट गर्नुपर्छ, आणविक अक्सिजन खपतको प्रत्यक्ष दरका रूपमा होइन।

समय मापन सुविधाजनक दायरामा परोस् भनेर जीवितता परीक्षणमा भन्दा धेरै पातलो रञ्जक प्रयोग गर्नुहोस्। AQA को A level अनिवार्य प्रयोगात्मक पुस्तिका ले यसलाई राम्ररी मानकीकृत गरेको छ: करिब 30 C सम्म तताइएको 100 mL पानीमा 1 g ग्लुकोज, प्रयोग गर्नुअघि तुरुन्तै थपिएको 5 g सुक्खा यीस्ट, र 1% मूल घोलको 0.1 mL लाई तनुकरण गरेर 100 mL बनाउँदा प्राप्त हुने करिब 0.001% प्रयोगयोग्य रञ्जक घोल। यीस्ट–ग्लुकोज निलम्बनको 2 mL मा प्रयोगयोग्य रञ्जक घोलको 2 mL मिसाउनुहोस्, परीक्षण तापक्रममा सन्तुलित हुन दिनुहोस्, एकपटक 10 सेकेन्ड हल्लाउनुहोस्, समयगणना सुरु गर्नुहोस् र फेरि नहल्लाउनुहोस्। हल्लाउँदा अक्सिजन फेरि प्रवेश गर्छ र नली फेरि नीलो हुन्छ; यो प्रक्रियाबाट उत्पन्न हुने सबैभन्दा ठूलो विकृति हो। AQA का अनुसार यो मिश्रण सामान्यतया 35 C मा करिब 5 मिनेटभित्र रङहीन हुनुपर्छ। परीक्षणका औसत समयहरू 20 C मा 275 s, 35 C मा 128 s र 45 C मा 145 s थिए। यी एउटै प्रयोग व्यवस्थाका उदाहरण हुन्, सबै अवस्थामा लागू हुने मानक होइनन्। नियन्त्रित अवस्थामा अपचयन दर र चयापचयमा सक्रिय यीस्टबीचको परिमाणात्मक सम्बन्धलाई अपचयनसम्बन्धी विशिष्ट अध्ययनहरूले समर्थन गर्छन्। यसमा PMID 25773544 अन्तर्गत सूचीकृत अध्ययन र Yeast (2014) मा प्रकाशित क्रियाविधिसम्बन्धी अध्ययन समावेश छन्।

समयक्रम प्रदर्शन (मौलिक सामग्री)

तलको तालिका यस लेखका लागि माथि वर्णन गरिएको AQA शैलीको व्यवस्था प्रयोग गरी तयार गरिएको मौलिक प्रदर्शन हो: 2 mL यीस्ट–ग्लुकोज मिश्रण र करिब 0.001% प्रयोगयोग्य रञ्जक घोलको 2 mL, एकपटक 10 सेकेन्ड हल्लाउने, त्यसपछि नचलाइकन इन्क्युबेसन गर्ने। प्रविष्टिहरू विद्यार्थी समूहले अभिलेख गर्नुपर्ने ढाँचाका उदाहरण हुन्। दर सूचकाङ्कलाई 1 लाई रङहीन हुन लागेको समय, सेकेन्डमा, ले भाग गरेर परिभाषित गरिएको छ। यही नली व्यवस्था प्रयोग गरी परीक्षण गर्नुहोस् र यी प्रविष्टिहरूको ठाउँमा मापन गरिएका मान राख्नुहोस्।

नली A, B र C का लागि तापक्रमको सापेक्ष दर सूचकाङ्कको ग्राफ बनाउनुहोस्। वक्र पहिले माथि उठ्छ, त्यसपछि समतल हुन्छ वा तल झर्छ। यो इन्जाइमद्वारा सञ्चालित प्रक्रियाको अपेक्षित ढाँचा हो, सीधा रेखा होइन। नली D, E र F त्यो वक्रका तथ्याङ्क बिन्दु होइनन्। तिनीहरू वक्रको अर्थ बुझ्न सघाउने नियन्त्रण हुन्।

प्रत्येक परीक्षणलाई अर्थपूर्ण बनाउने नियन्त्रणहरू

हरेक श्वसन परीक्षणसँग तीनवटा सहायक नियन्त्रण चाहिन्छ। उमालेको वा मारिएको यीस्ट, ग्लुकोज र रञ्जकको मिश्रण नीलै रहनुपर्छ, जसले छिटो अपचयन जीवित चयापचयमा निर्भर हुन्छ भन्ने पुष्टि गर्छ। थप ग्लुकोज नभएको जीवित यीस्ट र रञ्जकको मिश्रण सब्स्ट्रेट नियन्त्रण हो। तर यीस्टले आन्तरिक सञ्चित पदार्थ उपयोग गर्ने भएकाले बिस्तारै रङहीन हुने अपेक्षा गर्नुहोस्। यीस्ट नभएको ग्लुकोज र रञ्जकको मिश्रण रासायनिक ब्ल्याङ्क हो। यो आवश्यक छ, किनकि क्षारीय अवस्थामा ग्लुकोजले कुनै कोष उपस्थित नभए पनि मेथिलिन ब्लुको अपचयन गर्न सक्छ।

जीवितता गणनालाई फरक प्रकारको नियन्त्रण चाहिन्छ: प्रक्रियाको एकरूपता। रञ्जकको उही मूल घोल, उही मिश्रण अनुपात, उही रञ्जन अन्तराल, उही गणना कक्ष क्षेत्र, उही कोपिला र सीमारेखा नियम प्रयोग गर्नुहोस्। सम्भव भएसम्म नमुनाको पहिचान नखुलाई गणना गर्नुहोस्। दुई परीक्षणकर्ताको नतिजा दस प्रतिशत बिन्दुले फरक पर्दा कार्यपत्रले प्रायः कारण देखाउँछ: फरक समय, नीलो मान्ने फरक सीमा वा फरक कोपिला गणना नियम। रञ्जित कोष तयार गर्ने र हेर्ने प्रविधिहरू ब्याक्टेरियाको सरल रञ्जन विधिहरू सँग सम्बन्धित छन्। विभिन्न नमुनामा रञ्जकले के चिनाउँछ भन्ने विस्तृत सर्वेक्षण सूक्ष्मदर्शन रञ्जन एटलस मा छ। नीलो रङको कुनै पनि तीव्रतालाई परिमाणात्मक रूपमा पढ्नुको पछाडिको भौतिक विज्ञानका लागि, अवस्था उल्लेख गरिएको अवशोषण सन्दर्भले प्रत्येक गुणाङ्कसँग त्यसको विलायक, pH र सान्द्रताका अवस्थाहरू किन उल्लेख गर्नुपर्छ भन्ने व्याख्या गर्छ।

प्रश्नअनुसार परीक्षण रोज्नुहोस्। अहिले कति कोष जीवित छन् भन्ने गणनाको प्रश्न हो, जसको उत्तर सूक्ष्मदर्शक र कार्यपत्रबाट पाइन्छ। यो यीस्ट संवर्धनले कति सक्रिय रूपमा श्वसन गरिरहेको छ भन्ने गतिविज्ञानको प्रश्न हो, जसको उत्तर स्टपवाच र नियन्त्रित नलीहरूबाट पाइन्छ। मेथिलिन ब्लुले दुवै काम गर्छ, तर एउटै नलीमा एउटै समयमा कहिल्यै होइन।