EMB अगरमा E. coli र अन्य कोलोनीहरूको रूप बुझ्ने

एक विद्यार्थीले अज्ञात नमुनालाई इओसिन मिथिलिन ब्लु अगरमा स्ट्रिक गर्छन्, रातभर इन्क्युबेट गर्छन् र फर्कँदा प्लेटमा हरियो झिलमिलाहट भएका गाढा रङका कोलोनीहरू देख्छन्। नोटबुकमा लेखिन्छ, "E. coli, पुष्टि भयो।" यो लेखाइले प्लेटले समर्थन गर्न सक्नेभन्दा बढी दाबी गर्छ। प्लेटले निश्चित परिस्थितिमा वृद्धि र किण्वनको लक्षणगत रूप देखाउँछ। प्रजातिको पहिचान छुट्टै दाबी हो, जसका लागि छुट्टै प्रमाण चाहिन्छ।

यो मार्गदर्शिकाले EMB अगरका नतिजालाई व्याख्या गर्नुपर्ने विषयका रूपमा लिन्छ। यसले आधारभूत अवधारणा बुझाउँछ, नियन्त्रण नमुनासहितको उदाहरणात्मक प्लेट चित्रसङ्ग्रह प्रस्तुत गर्छ र पाठ्यपुस्तकमा देखाइने रूपले भ्रममा पार्ने अवस्थाहरू औँल्याउँछ।

प्लेटको पछाडिको अवधारणा

EMB अगर चयनात्मक र विभेदकारी दुवै हुन्छ। इओसिन Y र मिथिलिन ब्लु रञ्जकहरूले धेरै ग्राम-पोजिटिभ जीवहरूको वृद्धि दबाउँछन्, त्यसैले यो माध्यमले ग्राम-नेगेटिभ जीवहरूको वृद्धिलाई अनुकूलता दिन्छ। यिनै रञ्जकले सूचकको काम पनि गर्छन्: कुनै जीवले उपलब्ध चिनीको किण्वन गरेर स्थानीय रूपमा पर्याप्त अम्ल उत्पादन गर्दा कोलोनीले धेरै रञ्जक ग्रहण गर्छ र गाढा बैजनीदेखि नीलो-कालो हुन्छ। तीव्र अम्ल उत्पादन हुँदा कोलोनीको सतहमा धातुजस्तो हरियो, कोणअनुसार बदलिने चमक देखिन सक्छ। इओसिन मिथिलिन ब्लु अगर प्लेटका लागि ASM प्रोटोकल ले चयन र विभेदीकरणको यो संयोजन वर्णन गर्छ र शिक्षणका लागि सन्दर्भ तस्बिरहरू उपलब्ध गराउँछ।

कुनै पनि नतिजा बुझ्नुअघि एउटा विवरण महत्त्वपूर्ण हुन्छ: कुन फर्मुलेसन प्रयोग भइरहेको छ भन्ने जाँच्नुहोस्। पुरानो Holt Harris Teague फर्मुलेसनमा ल्याक्टोज र सुक्रोज दुवै हुन्छन्, जबकि Levine EMB मा ल्याक्टोज मात्र हुन्छ। ल्याक्टोजको किण्वन नगर्ने तर सुक्रोजको किण्वन गर्ने जीव, जस्तै Serratia marcescens का धेरै आइसोलेट, यी दुई संस्करणमा फरक देखिन सक्छन्। EMB माध्यमका लागि उत्पादकको दस्तावेज ले फर्मुलेसनको यो भिन्नता स्पष्ट रूपमा उल्लेख गर्छ। नतिजासँगै उत्पादक र फर्मुलेसन पनि नोटबुकमा लेख्नुहोस्।

तयार गरिएको तर नमुना नरोपिएको EMB अगर सामान्यतया रातो-खैरोदेखि रातो-बैजनी हुन्छ, कहिलेकाहीँ हल्का हरियो आभा वा मसिनो अवक्षेप पनि हुन्छ। त्यो पृष्ठभूमिको रङ वृद्धि होइन। प्रत्येक अवलोकनलाई नमुना नरोपिएको प्लेट वा अभिलेखित आधारभूत अवस्थासँग तुलना गर्नुहोस्। शिक्षण प्रोटोकलले अन्यथा तोकेको छैन भने, 35 देखि 37 C मा अक्सिजनयुक्त अवस्थामा करिब 18 देखि 24 घण्टा इन्क्युबेट गरेपछि प्राथमिक प्लेटको अवलोकन गर्नुहोस्। लामो इन्क्युबेसनले किण्वनको देखिने रूप बदल्न सक्छ।

प्लेटलाई कसरी हेर्ने

दुई प्रकारको प्रकाश प्रयोग गर्नुहोस्। पहिले परावर्तित वा छड्के प्रकाशमा प्लेट निरीक्षण गर्नुहोस् र त्यसलाई ढल्काउनुहोस्: धातुजस्तो चमक दृश्य कोणअनुसार बदलिन्छ र देखिन वा हराउन सक्छ। त्यसपछि कोलोनीको रङ र गाढा केन्द्र मूल्याङ्कन गर्न प्लेटबाट पार हुने प्रकाशमा हेर्नुहोस्। राम्ररी छुट्टिएका कोलोनीहरूबाट अवलोकन गर्नुहोस्, किनकि भीड र छिमेकी कोलोनीहरूले स्थानीय अम्ल सञ्चय बदल्छन् र रङलाई दबाउन वा बढी गाढा देखाउन सक्छन्। ASM चित्र सङ्ग्रह ले यो प्रत्यक्ष देखाउँछ: मिश्रित कल्चरमा वरिपरिका जीवहरूले अम्लीय वातावरण बदल्दा E. coli ले अपेक्षित चमक गुमाउन सक्छ।

अभ्यासले अनुमति दिएसम्म नियन्त्रण नमुनाहरू समावेश गर्नुहोस्। शिक्षणमा प्रचलित एउटा समूहमा नीलो-कालो रङ र धातुजस्तो चमकको लक्षणगत रूपका लागि E. coli ATCC 25922, रङहीन लक्षणगत रूपका लागि Salmonella Typhimurium ATCC 14028 वा Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 जस्ता किण्वन नगर्ने जीव, र वृद्धि-अवरोध नियन्त्रणका लागि Enterococcus faecalis वा Staphylococcus aureus जस्ता ग्राम-पोजिटिभ जीव राखिन्छन्। यी EMB माध्यमका मानक गुणस्तर नियन्त्रण तालिकाहरूमा सूचीबद्ध छन्। पोजिटिभ नियन्त्रणमा चमक छैन भने, अज्ञात नमुनामाथि शङ्का गर्नुअघि इन्क्युबेसन, कोलोनीको भीड वा फर्मुलेसनमाथि शङ्का गर्नुहोस्।

उदाहरणात्मक प्लेट चित्रसङ्ग्रह

तलका प्लेटहरू सिर्जना गरिएका दृष्टान्त हुन्, वास्तविक कल्चरका तस्बिर होइनन्। यिनले खोज्नुपर्ने ढाँचा देखाउँछन्, कुनै एक स्ट्रेनको ठ्याक्कै रङ होइन। यिनलाई ASM सन्दर्भ तस्बिरहरू र शिक्षण प्रयोगशालाका वास्तविक प्लेटहरूसँग तुलना गर्नुहोस्।

प्लेट 1: EMB अगरमा Escherichia coli, तीव्र रूपमा ल्याक्टोज किण्वन गर्ने जीव

EMB अगरमा E. coli सामान्यतया गाढा बैजनीदेखि नीलो-कालो हुन्छ। तीव्र अम्ल उत्पादनका कारण प्रायः यसको केन्द्र गाढा हुन्छ र धातुजस्तो हरियो चमक देखिन्छ। विद्यार्थीहरूले खोज्ने प्रसिद्ध विशेषता यही चमक हो, तर यसलाई परिभाषाका रूपमा होइन, सहायक प्रमाणका रूपमा लिनुहोस्। चमकको तीव्रता स्ट्रेन, इन्क्युबेसन अवधि, कोलोनीको घनत्व र हेर्ने कोणअनुसार फरक हुन्छ। चमक नहुँदैमा E. coli होइन भन्न मिल्दैन, र चमकविनाको गाढा कोलोनीले अन्य धेरै किण्वन गर्ने जीवहरूतर्फ पनि सङ्केत गर्छ। थप कामका लागि भीड भएको भागबाट नतिजा बुझ्नुको सट्टा राम्ररी छुट्टिएको कोलोनी छान्नुहोस्।

प्लेट 2: EMB अगरमा Klebsiella pneumoniae, श्लेष्मीय किण्वन गर्ने जीव

EMB अगरमा Klebsiella pneumoniae ले सामान्यतया गुलाबी-बैजनीदेखि खैरो-बैजनी रङका ठूला, टल्किने, श्लेष्मीय कोलोनी बनाउँछ। तिनको केन्द्र प्रायः गाढा हुन्छ, तर सामान्यतया बलियो धातुजस्तो चमक हुँदैन। Enterobacter जस्ता सम्बन्धित किण्वन गर्ने जीवहरूमा पनि यस्तै आकृति देखिन्छ। श्लेष्मीय बनावट र कोलोनीको आकार पनि अवलोकनका अङ्ग हुन्: सानो र समतल गुलाबी कोलोनीको सङ्केतात्मक महत्त्व ठूलो, गुम्बजाकार श्लेष्मीय कोलोनीको भन्दा फरक हुन्छ। E. coli को हकमा जस्तै, प्लेटले किण्वनको लक्षणगत रूप सुझाउँछ, र प्रजाति तहमा नाम दिन तल वर्णन गरिएको जैवरासायनिक पुष्टि चाहिन्छ।

प्लेट 3: EMB अगरमा Salmonella र किण्वन नगर्ने अन्य जीव, रङहीन कोलोनी

EMB अगरमा Salmonella र ल्याक्टोजको किण्वन नगर्ने सम्बन्धित जीवहरू, जसमा Shigella र धेरै Pseudomonas आइसोलेट पर्छन्, सामान्यतया रङहीनदेखि अर्धपारदर्शी वा फिक्का अम्बर रङका कोलोनीका रूपमा बढ्छन्। केही फर्मुलेसन र परिस्थितिले हल्का गुलाबी आभा दिन्छन्, त्यसैले फिक्का गुलाबी कोलोनी स्वतः किण्वन गर्ने जीव हुँदैन। EMB ले Salmonella लाई Shigella वा किण्वन नगर्ने अन्य जीवबाट छुट्याउँदैन; त्यो भिन्नता पछिका परीक्षणले छुट्याउनुपर्छ। ल्याक्टोज-पोजिटिभ Salmonella स्ट्रेनहरूमा E. coli जस्ता धातुजस्तो चमक भएका कोलोनी अभिलेखित भएका छन् भन्ने पनि ध्यान दिनुहोस्। एउटै प्लेटबाट निष्कर्षमा पुग्न नसकिने यो अर्को कारण हो।

प्लेट 4: Serratia marcescens र फर्मुलेसनले सिर्जना गर्ने भ्रम

Serratia marcescens का लागि छुट्टै खण्ड आवश्यक छ, किनकि विद्यार्थीहरूले प्रायः रातो कोलोनी अपेक्षा गर्छन् र त्यसपछि प्लेटको गलत व्याख्या गर्छन्। अधिकांश क्लिनिकल आइसोलेटले ल्याक्टोजको किण्वन गर्दैनन्, त्यसैले Levine EMB मा ती सामान्यतया फिक्का वा हल्का रङका देखिन्छन्। धेरै आइसोलेटले सुक्रोजको किण्वन गर्ने भएकाले सुक्रोज भएको फर्मुलेसनले अझ गाढा वा अम्लसँग बढी सम्बन्धित प्रतिक्रिया दिन सक्छ। 35 देखि 37 C मा परिचित रातो प्रोडिजियोसिन वर्णक पनि अपेक्षा नगर्नुहोस्; इन्क्युबेटरको तापक्रममा वर्णक उत्पादन भरपर्दो हुँदैन। प्रोटोकलले EMB अगरमा Serratia marcescens उल्लेख गर्दा त्यो कथनले कुन फर्मुलेसन मानेको छ भन्ने जाँच्नुहोस्। Serratia को चयापचयसम्बन्धी समीक्षा ले यस भ्रमको पछाडिको ल्याक्टोज-नेगेटिभ र सुक्रोजमा फरक पर्ने ढाँचा संक्षेपमा प्रस्तुत गर्छ।

प्लेट 5: नियन्त्रण नमुना र वृद्धि अवरुद्ध भएका जीव

Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus र Bacillus जस्ता ग्राम-पोजिटिभ जीवहरूको वृद्धि EMB अगरमा सामान्यतया अवरुद्ध वा उल्लेखनीय रूपमा दबिएको हुन्छ, यद्यपि प्रत्येक स्ट्रेनमा अवरोध पूर्ण हुँदैन। नियन्त्रण नमुनाहरूको समूहले अवलोकनलाई विश्वसनीय बनाउँछ: E. coli नियन्त्रणमा नीलो-कालो रङ र चमकसहित राम्रो वृद्धि देखिनुपर्छ, किण्वन नगर्ने जीवको नियन्त्रणमा रङहीन वृद्धि देखिनुपर्छ, र वृद्धि-अवरोध नियन्त्रणमा थोरै वा कुनै वृद्धि नदेखिनुपर्छ। वृद्धि-अवरोध नियन्त्रण राम्ररी बढ्छ भने चयनात्मक चरण असफल भएको छ र त्यस ब्याचका अरू सबै अवलोकन शङ्कास्पद हुन्छन्। रञ्जन विधिहरूले कल्चर माध्यमभन्दा फरक प्रश्नको उत्तर दिन्छन्; प्रयोगशालामा स्लाइड रञ्जनको पक्षका लागि मिथिलिन ब्लु रञ्जन चित्रसङ्ग्रह हेर्नुहोस्।

सीमाभित्रको तुलना

तीन वाक्यले भ्रमपूर्ण रूपहरूको सार दिन्छन्। गाढा रङ हुनु भनेको E. coli हुनु होइन, किनकि Klebsiella, Enterobacter र किण्वन गर्ने अन्य जीवहरूले चमकविना पनि गाढा केन्द्र विकास गर्छन्। गुलाबी हुनु भनेको Klebsiella हुनु होइन, किनकि मध्यम वा सुस्त किण्वन गर्ने जीव र सामान्यतया किण्वन नगर्ने मानिएका केही जीव गुलाबी वा हल्का बैजनी देखिन्छन्। चमक हुनु भनेको निश्चित रूपमा E. coli हुनु होइन, किनकि तीव्र किण्वन गर्ने अन्य जीवहरूले पनि त्यो उत्पन्न गर्न सक्छन्। शिक्षण प्रोटोकल र यसका मिश्रित कल्चरका चित्रहरू ले यी प्रत्येक त्रुटि देखाउँछन्।

पुष्टिका सीमाहरू

EMB अगरले लक्षणगत रूप देखाउँछ, प्रजाति होइन। फरक जीवहरूको कोलोनीको रूप एउटै हुन सक्छ, र एउटै जीव पनि स्ट्रेन, उमेर, कोलोनीको भीड, फर्मुलेसन र इन्क्युबेसनका कारण आफ्नो पाठ्यपुस्तकमा देखाइएको रूपभन्दा फरक हुन सक्छ। त्यसैले शिक्षण र क्लिनिकल कार्यप्रवाहहरूले EMB को आकृतिलाई प्रारम्भिक अनुमानका रूपमा लिन्छन्।

विद्यार्थीका लागि प्रमाणका आधारमा उचित ठहर गर्न सकिने कार्यप्रवाह यस्तो हुन्छ: छुट्टिएको कोलोनीको वर्णन गर्नुहोस् (आकार, रङ, केन्द्र, छड्के प्रकाशमा चमक, श्लेष्मीय विशेषता), फर्मुलेसन, इन्क्युबेसन अवधि र तापक्रम तथा नियन्त्रण नमुनाहरू अभिलेख गर्नुहोस्; त्यसपछि कुनै पनि पुष्टिकरण परीक्षण गर्नुअघि राम्ररी छुट्टिएको कोलोनीलाई शुद्ध कल्चर प्राप्त गर्न उपकल्चर गर्नुहोस्। सामान्य थप परीक्षणमा E. coli र कोलिफर्मको अनुमानित पहिचानका लागि ग्राम रञ्जन र IMViC प्रतिक्रियाहरू, आन्त्रीय जीवहरूका लागि TSI वा KIA र जीवविशेषका जैवरासायनिक परीक्षण समूहहरू पर्छन्। कामको आवश्यकताअनुसार सिरोलोजिकल परीक्षण, MALDI TOF वा अन्य प्रमाणित पहिचान विधि पनि प्रयोग गरिन्छन्। चयनात्मक र विभेदकारी आन्त्रीय माध्यमहरूमा EMB को स्थानबारे पृष्ठभूमिका लागि आन्त्रीय कल्चर माध्यमका परिचयहरू र ग्राम रञ्जनपछिका परीक्षण हेर्नुहोस्। नीलो स्लाइड रञ्जनले के प्रमाणित गर्न सक्छ र के सक्दैन भन्ने सम्बन्धित प्रश्नमा, मिथिलिन ब्लु रञ्जन चित्रसङ्ग्रह ले पनि यही दृष्टिकोणअनुसार अवलोकन र निष्कर्षलाई अलग राख्छ।

निष्कर्षअघि अवलोकन लेख्नुहोस्। "24 घण्टामा Levine EMB मा कोणअनुसार बदलिने हरियो चमक भएका गाढा नीलो-कालो कोलोनी, तीव्र ल्याक्टोज किण्वनसँग मेल खाने" भन्ने कथन प्रमाणका आधारमा उचित ठहर गर्न सकिन्छ। "E. coli, पुष्टि भयो" भन्नका लागि प्लेटले मात्र दिन नसक्ने पुष्टिकरण चरण आवश्यक हुन्छ।