Nytt metylenblått og retikulocyttfarging: et eget fargestoff og en metode for levende celler

En student forbereder en retikulocyttelling, bestiller metylenblått, blander det med blod og ser nesten ingenting. En medstudent bruker en flaske merket nytt metylenblått og får tydelige blå filamenter i en del av de røde blodcellene. Den første studenten antar at innholdet i den andre flasken er ferskere eller mer konsentrert. Ingen av delene stemmer. Den inneholder et annet molekyl.

Denne begrepsforvekslingen ligger bak det meste av forvirringen på dette området. Navnet antyder at nytt metylenblått er en forbedret utgave av metylenblått. Kjemien viser noe annet. Nytt metylenblått N er et eget fenotiazinfargestoff med sitt eget Colour Index-nummer, sitt eget substitusjonsmønster og sin egen standardiserte rolle i hematologien. Når dette skillet er klart, blir resten av metoden lett å forstå: hvorfor cellene må være levende når de farges, hva som regnes som en retikulocytt, hvilken rolle Heinz-legemer har, og når briljantkresylblått kommer inn i bildet.

Det korte svaret

Nytt metylenblått N, hematologireagenset, identifiseres vanligvis som Basic Blue 24 i PubChem-oppføringen for nytt metylenblått, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, med formelen C18H22ClN3S. Vanlig metylenblått er metyltioniniumklorid, Basic Blue 9, i sin PubChem-oppføring, C.I. 52015, CAS 61-73-4, med formelen C16H18ClN3S. Strukturelt har nytt metylenblått to metylgrupper på ringen og etylaminosidekjeder der metylenblått har dimetylaminogrupper. Denne forskjellen endrer fargeegenskapene. Hematologiske lærebøker beskriver vanlig metylenblått som et relativt dårlig fargestoff for retikulocytter, mens nytt metylenblått gir dypere og jevnere farging. Sammenligningen er oppsummert i ScienceDirects emneoversikt om nytt metylenblått.

Ja, nytt metylenblått er et supravitalt fargestoff. Supravital farging betyr farging av levende celler etter at de er tatt ut av kroppen, og før fiksering, slik det defineres i NCBIs gjennomgang av prinsippene for supravital farging. Både nytt metylenblått og briljantkresylblått tilhører denne kategorien, og CLSIs retikulocyttstandard omtaler nytt metylenblått uttrykkelig som et supravitalt fargestoff. Studenter plasserer noen ganger dette i samme kategori som Romanowsky-farging av fikserte utstryk. Den forståelsen fungerer ikke her. Fikserer man først, slutter metoden å virke.

For lesere som vil holde styr på lignende fargestoffnavn, tar metylblått sammenlignet med metylenblått for seg en annen og større forveksling mellom et anionisk triarylmetanfargestoff og den kationiske fenotiazinfamilien. Oversikten over laboratoriefarging setter supravitale metoder i sammenheng med metoder for fikserte utstryk, og veiledningen om blodcellemorfologi viser hvor retikulocyttvurdering passer inn i den bredere differensialtellingen.

Én merknad ved bruk av kataloger: En egen sinkklorid-dobbeltsaltform av nytt metylenblått finnes under CAS 6586-05-6. En metodedel bør derfor oppgi saltform og leverandør, ikke bare det vanlige navnet.

Hva supravital farging faktisk gjør

En retikulocytt er en ung rød blodcelle som har mistet kjernen, men fortsatt har rester av ribosomalt RNA. I et ufarget våtpreparat er dette RNA-et usynlig. Det supravitale fargestoffet trenger inn i den levende cellen og utfeller eller aggregerer RNA-et til blå granuler og filamenter, det retikulofilamentøse materialet som ses ved oljeimmersjon. Nettverket er altså et produkt av fargingen, ikke et ferdigdannet skjelett som bare venter på å få farge. Derfor er protokollvariabler som fargestoffkonsentrasjon, buffer, forholdet mellom blod og fargestoff, temperatur og tid like viktige som navnet på fargestoffet.

Den praktiske konsekvensen er en streng rekkefølge: Bland først antikoagulert blod med fargestoff, inkuber, lag deretter utstryk og undersøk dem ufiksert og uten kontrastfarging. Fiksering før farging, eller kontrastfarging som skjuler svake filamenter, ødelegger informasjonen tellingen bygger på.

En praktisk retikulocyttprotokoll med nytt metylenblått

Det finnes ingen universell formulering, så oppgi hvilken som brukes. Tre dokumenterte varianter viser spennvidden.

Den klassiske Brecher-prosedyren bruker omtrent 0.5 prosent nytt metylenblått med kaliumoksalat, blandet i like volumer med godt blandet EDTA-blod og inkubert i omtrent 10 til 15 minutter ved romtemperatur. Etter forsiktig omblanding lages tynne kileutstryk som lufttørkes og undersøkes ufiksert med 100x oljeimmersjonsobjektiv. NCBIs prosedyre for retikulocyttelling beskriver denne arbeidsflyten og tellerammen som brukes sammen med den.

Dacie og Lewis-varianten bruker 1.0 prosent nytt metylenblått i citrat-saltløsning, blandet med 2 til 4 volumer blod og holdt ved 37 C i 15 til 20 minutter før utstrykene lages. En nyere harmonisering av CLSI H44-prosedyren brukte en mindre konsentrert løsning på 0.1 prosent i fosfatbufret saltløsning ved pH 7.4, med inkubasjon ved 20 C i 10 minutter og uten fiksering, som beskrevet i harmoniseringsstudien av NMB fra 2026.

Tellereglene er felles for variantene. Registrer en celle som en retikulocytt når den inneholder minst to tydelig atskilte blåfargede granuler eller filamentsegmenter. Dette utelukker isolerte fargestoffavleiringer. Tell minst 1,000 røde blodceller ved rutinearbeid, og rapporter retikulocytter som en prosentandel. Ved lave prosentandeler krever statistikken flere celler. En gjennomgang av CLSI H44-metodikken bemerker at det ved omtrent 1 prosent retikulocytter trengs rundt 4,400 celler for å få tellevariasjonen ned til 5 prosent, i gjennomgangen av CLSI H44 hos De Gruyter. En Miller-skive i okularet gjør det praktisk mulig å telle mange celler. Filtrer fargestoffet eller tilbered det ferskt, fordi utfellinger kan ligne granulære inklusjoner.

Heinz-legemer i samme preparat

Det samme supravitalt fargede utstryket kan også vise Heinz-legemer, som er aggregater av oksidert og denaturert hemoglobin, ikke rester av RNA. I preparater med nytt metylenblått fremstår de som runde legemer, ofte enkeltvis og nær membranen, med lysere blåfarging enn det retikulofilamentøse materialet. De bevares dårlig ved fiksering og kontrastfarging, så undersøk det ufikserte utstryket. En nyere protokoll med 20 mikroliter EDTA-blod og 20 mikroliter 1 prosent nytt metylenblått samt 15 minutters inkubasjon kvantifiserte celler med Heinz-legemer blant 250 erytrocytter, som beskrevet i PMC-studien som rapporterer denne prosedyren.

To skiller hindrer feiltolkning. For det første farger metylfiolett og krystallfiolett Heinz-legemer mer intenst enn nytt metylenblått, som nevnt i ScienceDirects emneoversikt om Heinz-legemer. Nytt metylenblått er det praktiske valget når retikulocytter og Heinz-legemer skal vurderes sammen, men ikke det kraftigste fargestoffet spesifikt for Heinz-legemer. For det andre gir HbH-inklusjoner ved bærertilstand for alfa-talassemi mange fine prikker over hele cellen etter supravital farging, mens klassiske Heinz-legemer er færre, større og ofte knyttet til membranen. Fargestoffavleiringer er en tredje kilde til forveksling: De ligger utenfor cellenes fokusplan og varierer mellom synsfelt.

Briljantkresylblått sammenlignet med nytt metylenblått

Begge fargestoffene brukes til supravital retikulocyttfarging, men standardiseringen favoriserer ett av dem. Retikulocyttmetoden CLSI H44-A2, utviklet sammen med International Council for Standardization in Haematology og oppført på CLSI H44-standardens side, angir farging av EDTA-blod med nytt metylenblått som den manuelle sammenligningsmetoden. Klassisk hematologiundervisning beskriver utseendet på samme måte: Nytt metylenblått gir dypere og jevnere filamentfarging, mens briljantkresylblått varierer mer mellom partier og prøver.

Denne statusen trenger et forbehold. ICSHs retningslinje for evaluering av analyseinstrumenter godtar manuell mikroskopi med nytt metylenblått som en referansebasert sammenligningsmetode, men omtaler den som subjektiv og relativt upresis. Flowcytometriske referanseprosedyrer foretrekkes der de er tilgjengelige. En sammenligning av 100 prøver fra 2022 fant mindre systematisk avvik fra analyseinstrumentet med briljantkresylblått enn med nytt metylenblått, som rapportert i PMC-sammenligningen av fargemetoder. En faglig holdbar oppsummering for studenter er derfor: Bruk nytt metylenblått som standardisert manuelt sammenligningsgrunnlag, kontroller enhver lokal metode med briljantkresylblått mot denne eller mot automatisert analyse, og forvent større spredning ved manuell mikroskopi uansett fargestoff. Eldre standardiseringslitteratur anbefalte også renset Azure B som et kjemisk renere alternativ fordi kommersielle fargestoffpartier varierte, i Marshalls studie om Azure B. Dette forklarer hvorfor reagenskvalitet fortsatt omtales i metodediskusjoner.

Slik unngår du de vanlige feilene

Fire feil forklarer de fleste mislykkede preparater. Å bestille vanlig metylenblått i stedet for nytt metylenblått N gir svak farging på grunn av kjemien, ikke teknikken. Fiksering eller kontrastfarging før avlesning fjerner det supravitale signalet. Å telle fargestoffutfellinger som granuler gir et for høyt resultat, noe regelen om to granuler og filtrert fargestoff forebygger. Å telle for få celler ved lave retikulocyttandeler gir et tilsynelatende presist tall med vide konfidensgrenser. Alle feilene har samme kjennetegn: Mikroskopøren skylder på mikroskopet for noe som ble avgjort i reagenstrinnet.