Måling av metylenblåtts virkninger på mitokondrier: oksygen, ATP og membranpotensial

Anta at et laboratorium tilsetter metylenblått til mitokondrier med svekket respirasjon og ser at oksygenforbruket øker. Den naturlige setningen å skrive er at fargestoffet gjenopprettet mitokondriefunksjonen. Den setningen kan være feil. Oksygenfluks, ATP-syntese og membranpotensial er tre forskjellige begreper. De deler samme organell på samme måte som sikkerhetskopiering, synkronisering og deling bruker samme skymappe: De er beslektet, men styres av ulike regler. Forveksler man det ene med det andre, svikter tolkningen, selv når hver måling er teknisk korrekt.

Metylenblått gjør slik forveksling sannsynlig fordi det deltar i systemet det måler. Det er en redokssykler som tar imot elektroner oppstrøms og avgir dem nedstrøms, et lipofilt kation som akkumuleres i energiserte mitokondrier, og en sterkt blå forbindelse som absorberer og emitterer lys i de samme bølgelengdebåndene som vanlige prober. Én enkelt måleverdi kan ikke dekke alt dette. Den pålitelige fremgangsmåten, som går igjen i mitokondriestudiene fra Budapest, er å måle oksygenfluks sammen med ATP-syntesehastighet, membranpotensial og frigjøring av hydrogenperoksid, med fargestoffspesifikke kontroller i hvert trinn.

Respirometri måler oksygenfluks, ikke energiutbytte

Høyoppløselig respirometri, enten med Oroboros Oxygraph eller Seahorse ekstracellulær fluksanalysator, rapporterer én ting: hvor raskt oksygen reduseres. Den rapporterer ikke hvor mange protoner som ble pumpet per elektron, hvor mye av gradienten som ble bevart, eller om ATP-syntase utnyttet den.

Terminologien er viktig. I isolerte mitokondrier gir substrat uten ADP lekkasjerespirasjon, substrat med mettende ADP gir kapasitet for oksidativ fosforylering, og titrering med en frikobler gir maksimal elektronoverføringskapasitet. I intakte celler er Seahorse-ekvivalentene basal respirasjon, oligomycinsensitiv ATP-koblet respirasjon, protonlekkasje, FCCP-definert maksimal respirasjon og rotenon- og antimycinresistent ikke-mitokondrielt oksygenforbruk. Å kalle Seahorse-resultater State 3 og State 4 gir inntrykk av en presisjon som preparatet ikke støtter, slik Agilents rammeverk for Mito Stress Test gjør klart.

Metylenblått bryter den intuitive koblingen mellom mer oksygen og mer energi. I isolerte hjernemitokondrier fra marsvin økte 100 nM til 1 uM fargestoff oksygenforbruket i hvile med substratene glutamat pluss malat, succinat og alfa-glyserofosfat, med en økning på omtrent 64 prosent med alfa-glyserofosfat. Likevel var ADP-stimulert respirasjon i friske mitokondrier i hovedsak uendret, ifølge studien av isolerte hjernemitokondrier. Fordi lekkasjen økte mens ADP-stimulert fluks forble uendret, synker det beregnede respiratoriske kontrollforholdet. Denne nedgangen betyr ikke at fargestoffet skadet mitokondriene. Den betyr at fargestoffet la til en oksygenforbrukende redokssyklus i tillegg til den normale respirasjonen. En analyse av oksygenforbruk med metylenblått som bare rapporterer økningen, har målt reell kjemi uten å si noe om energibevaring.

Forsøkene med gjenoppretting viser det samme gapet i større skala. Med kompleks I blokkert økte oksygenfluksen omtrent tre ganger, mens ATP-syntesen bare økte omtrent 1.5 ganger. Mer oksygen nådde elektroden. Mindre av det bidro til ATP-produksjon. Enhver påstand om forbedret oksidativ fosforylering trenger ATP-siden av regnskapet, helst uttrykt som et forhold mellom ATP og oksygen, med angitt konvensjon for nevneren.

ATP-analyser måler syntesehastighet, som ikke kan erstattes av innhold

En ATP-analyse besvarer et annet spørsmål: hvor mye ATP som dannes per tidsenhet. En kinetisk måling, enten luminescens fra ildflueluciferase fulgt over minutter eller en koblet analyse med heksokinase og glukose-6-fosfatdehydrogenase avlest ved 340 nm, gir en hastighet. Én enkelt endepunktsmåling av totalt ATP gir et innhold, som gjenspeiler syntese minus forbruk og i seg selv sier lite om oksidativ fosforylering.

Budapest-gruppen brukte den koblede enzymatiske metoden med hemmet adenylatkinase og fant at metylenblått ved 1 til 2 uM økte ATP-produksjonen beskjedent, men signifikant, i rotenonbehandlede og antimycinbehandlede mitokondrier. Dette er en reell gjenoppretting, og den er delvis. Studien av TEGDMA-toksisitet ga samme type svar i en annen modell: 5 mM av dentalmonomeren TEGDMA reduserte kompleks I-koblet respirasjon kraftig fra omtrent 286 til 28 fluksenheter, og 2 uM fargestoff brakte den tilbake til omtrent 86.

To kontroller er ufravikelige med en farget redoksforbindelse. Bruk først oligomycin for å fastslå hvor mye av den målte ATP-syntesen som avhenger av ATP-syntase. Utfør deretter en cellefri gjenfinningskontroll med en kjent mengde tilsatt ATP, komplett reagensblanding og nøyaktig de fargestoffkonsentrasjonene som brukes, som et minimum 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM. Fargestoffet kan absorbere emittert lys, hemme reporterenzymet eller endre reagensenes redokskjemi, og generell veiledning for luciferaseanalyser anbefaler biokjemiske kontrollanalyser nettopp for denne typen interferens. Ikke anta at 1 uM er fritt for artefakter fordi fluorescensslukking vanligvis er sterkere ved høyere konsentrasjoner.

Membranpotensialprober måler fargestoffets fordeling, ikke fluks

Safranin O, TMRM og TMRE, rhodamin 123 og JC-1 er alle membranpermeable kationer. De akkumuleres i den negativt ladede matriksen i samsvar med elektrokjemisk likevekt, så den samlede fluorescensen rapporterer potensialet indirekte gjennom probens plassering. Ingen av dem måler ATP eller elektronfluks.

Hver probe har en preparattype den passer best til. Safranin O passer til isolerte mitokondrier og permeabiliserte celler, vanligvis rundt 2 uM med eksitasjon nær 495 nm og emisjon nær 585 nm, i et slukkingsregime der opptak endrer den samlede fluorescensen. TMRM og TMRE passer til intakte celler ved lave nanomolare ladningskonsentrasjoner i en modus uten slukking, der depolarisering frigjør fargestoff og mitokondriell fluorescens avtar; ved høy ladning kan signalets retning snus gjennom selvslukking. JC-1 gir et praktisk forhold mellom grønt og rødt, men avhenger av ladning og mitokondriemasse, noe som gjør det svakere for kvantitativt arbeid enn nøye kontrollert TMRM. Disse avveiningene oppsummeres i en mye brukt oversiktsartikkel om prober for mitokondrielt membranpotensial.

Metylenblått gir optisk interferens nettopp ved arbeidskonsentrasjonene. Absorpsjonsbåndene nær 600 til 665 nm overlapper røde probers emisjon, så indre filtereffekter, slukking og absorpsjon av eksitasjonslys er alle plausible. Fargestoffet er også et annet lipofilt kation som selv endrer fordeling med potensialet som måles. Mottiltaket er redundans og blindprøver: probe alene, fargestoff alene, probe sammen med hver fargestoffkonsentrasjon, full depolarisering med FCCP som nullreferanse og helst en annen, optisk forskjellig probe. Studien av omgåelse av kompleks III etablerte denne fremgangsmåten ved å gjenta målingen av gjenopprettet membranpotensial med både safranin O og TMRM etter hemming med antimycin og myxotiazol, og oppnå samme kvalitative gjenoppretting. Én optisk reporter gir en indikasjon. To uavhengige reportere gir evidens.

Tre preparater, tre forskjellige spørsmål

Isolerte mitokondrier, permeabiliserte celler og intakte celler er ikke utskiftbare følsomhetsinnstillinger i én analyse. De er forskjellige konsepter med ulike funksjonsprinsipper.

Isolerte mitokondrier bevarer elektrontransportkjeden, den indre membranen og matriksens maskineri, mens plasmamembranen, cytosol og nettverksarkitekturen fjernes. Denne fjerningen er selve poenget: Substrater, ADP, inhibitorer og fargestoffkonsentrasjoner er nøyaktig definert, slik at man kan identifisere en reaksjonsvei. Kostnaden er tap av naturlig substrattilførsel, signalering og energibehov.

Permeabiliserte celler beholder mitokondriene i store deler av sin cellulære arkitektur, samtidig som eksogene substrater og ADP slipper gjennom den åpnede plasmamembranen. De er riktig verktøy for å identifisere en defekt i en substratspesifikk reaksjonsvei i en cellulær sammenheng. For kraftig permeabilisering skader den ytre membranen, og cytosolisk regulering vaskes bort.

Intakte celler bevarer alt: plasmamembranbarrieren, cytosoliske reduksjonsmidler, endogen substrattransport, mitokondrienettverket og ATP-behovet. De ligger nærmest fysiologien og lengst fra mekanismen, fordi opptak, reduksjon og sekvestrering av fargestoffet alle påvirker den effektive eksponeringen i mitokondriene.

TEGDMA-studien brukte alle tre nivåene bevisst: isolerte hjernemitokondrier for å undersøke fargestoffets gjenoppretting av oksidasjon og potensial, permeabiliserte stamceller fra tannpulpa hovedsakelig for å lokalisere skaden til kompleks I-koblet substratoksidasjon, og intakte stamceller for den fysiologiske nettoeffekten av 2 uM fargestoff på hemmet oksygenforbruk. For lesere som sammenligner mitokondrielle måleresultater på tvers av preparater, gir den tilhørende forklaringsartikkelen om hvordan metylenblått flytter elektroner gjennom respirasjonskjeden bakgrunn om reaksjonsveiene, mens veiledningen til å lese respirasjonsstudier med metylenblått dekker logikken bak konsentrasjoner og inhibitorer.

Kontroller som et redoksaktivt fargestoff krever

En redokssykler trenger en lengre kontrolliste enn en vanlig inhibitor, fordi kjemi fra fargestoffet alene kan etterligne biologi.

For respirometri brukes et kammer med bare buffer for å måle drift, et kammer med buffer og fargestoff uten biologisk materiale, fargestoff sammen med eventuelle ekstracellulære reduksjonsmidler som finnes i analysen, og rotenon pluss antimycin til slutt for å definere ikke-mitokondrielt oksygenforbruk i intakte celler. Merk at redusert fargestoff reoksideres ved å overføre elektroner til oksygen og danne hydrogenperoksid. En blindprøve med bare fargestoff uten elektrondonor undervurderer derfor det cellefrie oksygenforbruket som oppstår når NADH eller NADPH er tilgjengelig.

For hydrogenperoksid bør kalibrert Amplex UltraRed sammen med pepperrotperoksidase foretrekkes fremfor ikke-selektive DCFDA-fargestoffer. Verifiser med katalase, og test avhengighet av belysning, siden fargestoffet er en fotosensibilisator. Studien av hjernemitokondrier fant at peroksidbelastningen økte mer enn fire ganger ved bare 100 nM fargestoff, samtidig som fjerningen av peroksid gikk langsommere. Peroksidet ble dannet direkte av redusert fargestoff uten superoksid som mellomprodukt. Detaljer om probevalg og lyskontroller hører hjemme i den tilhørende artikkelen om måling av reaktive oksygenforbindelser i fargestoffeksperimenter, og det bredere spørsmålet om når peroksid virker som signal eller belastning, behandles sammen med cellulær redoksbalanse og påstander om antioksidanter.

For påstander om reaksjonsveier må begge inhibitorbindingsstedene i kompleks III testes: antimycin A ved Qi-stedet og myxotiazol ved Qo-stedet, samt et kompleks IV-endepunkt med cyanid. En tidligere studie av musehjerne rapporterte at fargestoffet gjenopprettet rotenonblokkert, men ikke antimycinblokkert respirasjon, mens den senere studien av tre arter fant delvis gjenoppretting med begge inhibitorene og evidens for direkte reduksjon av cytokrom c. Betrakt omgåelsen som forenlig med de nyere dataene, snarere enn endelig avklart, siden fargestoffkonsentrasjon, inhibitorbindingssted, substrattilstand og fargestoffets fordeling alle endrer den observerte ruten.

Matrise for valg av analyse

Bruk denne tabellen til å velge måling ut fra spørsmålet, ikke omvendt.

Minimumet for en overbevisende påstand er å bruke de samme fargestoffkonsentrasjonene, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM, til måling av oksygenfluks under lekkasje-, ADP-, oligomycin- og frikoblerbetingelser, ATP-syntesehastighet, membranpotensial med helst to prober og kalibrert peroksidfrigjøring med katalase og cellefrie kontroller. Rapporter det sammenhengende settet: oksygenfluks pluss ATP-hastighet pluss ATP per oksygen pluss potensial pluss peroksid. Hvert av disse tallene alene er en måling på jakt etter en mening.