Hvorfor metylenblått brukes som kontrastfarge ved syrefast farging

En tekniker undersøker et sputumutstryk etter hele fargesekvensen. Røde staver trer tydelig frem mot et blått felt, og svaret rapporteres som syrefaste basiller påvist. Dagen etter viser et annet objektglass et ensartet blått felt uten røde staver, og det rapporteres som negativt for tuberkulose. Én av disse rapportene hevder mer enn objektglasset gir grunnlag for, og det er ikke den første.

Forvirringen gjelder selve prinsippet. Teknikeren behandlet det blå fargestoffet som en del av påvisningskjemien, som om metylenblått bidro til å finne mykobakteriene. Det gjorde det ikke. Når metylenblått kommer i kontakt med objektglasset, er testen allerede over. Fargestoffet farger bare bakgrunnen slik at resultatet kan leses. Denne artikkelen forklarer formålet med metylenblått ved syrefast farging, hvorfor det er blått og ikke en annen farge, og hvilke konklusjoner rødt mot blått gir grunnlag for.

Det korte svaret

Syrefast farging er en differensialtest bygget på tre prinsipper. Karbolfuksin, primærfargen, drives inn i alle celler, også mykobakterier med voksaktig cellevegg. Syrealkohol, avfargingsmiddelet, fjerner det røde fargestoffet fra vanlige celler, men klarer ikke å trekke det ut av syrefaste celler. Metylenblått, kontrastfargen, farger deretter alt som avfargingsmiddelet har tømt for farge. Dermed blir ikke-syrefaste celler, vertsceller og celleavfall blått, mens syrefaste basiller forblir røde. Kontrastfargen gir kontrast. Den spiller ingen rolle i kjemien som gjør en celle syrefast.

Hva hvert trinn gjør

Diagrammet nedenfor viser arbeidsdelingen. Les det fra venstre mot høyre som en prosedyre, og les den nederste stripen som en påminnelse om at hver gruppe fargemetoder stiller ulike spørsmål.

Inntrengning kommer først. Mykobakterier motstår vanlige vannbaserte fargestoffer fordi cellehylsteret er uvanlig hydrofobt, så protokollen tvinger fargen inn. I Ziehl-Neelsen-metoden drives fenolholdig karbolfuksin gjennom den voksaktige veggen ved oppvarming til dampdannelse. I Kinyouns kalde metode erstattes varme med en langt sterkere formulering av primærfargen, og noen modifiserte varianter uten oppvarming tilsetter overflateaktive stoffer. American Society for Microbiologys protokoller for syrefast farging dokumenterer begge formuleringene side om side, og konsentrasjonsforskjellen er slående: omtrent 0.3 g basisk fuksin per 100 mL i metoden med oppvarming, mot omtrent 4 g i den kalde metoden.

Differensiering kommer som nummer to. Syrealkohol, vanligvis 3 mL konsentrert saltsyre i 97 mL etanol med 95 prosent styrke, vasker det røde fargestoffet ut av alle celler hvis vegg ikke gir noen særskilt motstand. Celler med intakt mykobakterielt lipidhylster holder på fargestoffet. Dette er trinnet hele metoden avhenger av, og det trinnet som er mest følsomt for teknikken, som omtalt nedenfor.

Kontrast kommer til slutt. Objektglasset har nå røde syrefaste celler på en nesten fargeløs bakgrunn av celler som er tømt for farge. Metylenblått ved 0.3 prosent w/v gjør denne bakgrunnen synlig igjen i en farge som skiller seg mest mulig fra rødt. Kontrastfargingen er kortvarig, vanligvis 20 til 30 sekunder i metoden med oppvarming og opptil noen få minutter i enkelte varianter av den kalde metoden. Tiden avhenger av protokollen, ikke av en egenskap ved selve fargestoffet.

Hvorfor dette fargestoffet, og hvorfor blått

Metylenblått er et kationisk basisk fargestoff. Det betyr at det fargede ionet har positiv ladning og binder seg til de negativt ladede overflatene på avfargede bakterier, vertsceller og celleavfall. OpenStax Microbiology beskriver dette ladningsprinsippet som det generelle prinsippet bak basiske fargestoffer. Men metylenblått er ikke kjemisk unikt i denne sammenhengen. Krystallfiolett og safranin er også basiske fargestoffer. Valget er optisk, ikke kjemisk.

Røde staver trenger en bakgrunn med en kontrasterende fargetone, og blått står i motsetning til rødt på den mest nyttige måten for lysfeltmikroskopi. Safranin ville vært en dårlig kontrastfarge fordi den endelige rosarøde fargen ligger for nær karbolfuksinet som er beholdt, og dermed visker ut nettopp det skillet prosedyren har skapt. Krystallfiolett ville gitt en mørk fiolett bakgrunn som konkurrerer med tynne røde basiller om oppmerksomheten. Det sterkeste beviset på at oppgaven er kontrast snarere enn kjemi, er at fargestoffet kan byttes ut: Grønne kontrastfarger som malakittgrønt og briljantgrønt brukes i enkelte veterinære og modifiserte protokoller, og testen fungerer fortsatt, fordi enhver tydelig forskjellig fargetone gjør samme jobb.

Dette har to praktiske følger. For det første angir standardoppskriften ingen pH-justering. Ikke forveksle denne vanlige vannbaserte løsningen på 0.3 prosent med alkaliske formuleringer som Loefflers metylenblått, som hører til et annet fargeprinsipp. For det andre er overdreven farging uheldig. Histologisk litteratur advarer uttrykkelig om at en for tett blå bakgrunn kan skjule fåtallige basiller. Å la fargestoffet dekke objektglasset lenger enn protokollen tillater, svekker derfor lesbarheten uten å gi noen gevinst.

Celleveggens kjemi som gjør testen mulig

Grunnen til at syrealkohol skiller mellom cellene, ligger i mykobakterienes cellehylster. Den strukturelle kjernen er mykolyl-arabinogalaktan-peptidoglykan-komplekset: peptidoglykan knyttet til arabinogalaktan, der de ytre endene bærer mykolsyrer med svært lange kjeder. Disse danner en lipidrik ytre mykomembran med uvanlig lav permeabilitet. Oversiktsartikkelen om mykobakterienes ytre membran beskriver denne arkitekturen i detalj. Barrieren virker i begge retninger. Den motstår inntrengning av fargestoff, og derfor krever inntrengningen varme eller en sterkere primærfarge. Den motstår også uttrekking av fargestoff, og derfor klarer ikke syrealkohol å fjerne karbolfuksin når det først er kommet inn. Vanlige bakterier mangler dette hylsteret og mister fargestoffet. Syrefasthet forstås derfor best som et lipidbarrierefenomen, ikke som at fuksin binder seg kjemisk til mykolsyre.

Denne kjemien forklarer også et vanlig mysterium: Mykobakterier farges dårlig og uforutsigbart med Gram-metoden og fremstår noen ganger som svakt fargede former med perlelignende struktur eller som ufargede skygger. Den hydrofobe veggen begrenser inntrengningen av krystallfiolett. Syrefast farging er ikke en modifisert Gram-farging. Den bygger på et annet differensieringsprinsipp knyttet til en annen egenskap ved celleveggen, slik sammenligningen av enkel farging og Gram-farging viser for de to andre metodene.

Tre metoder, tre spørsmål

For den bredere gruppen av bakteriefargemetoder med ett fargestoff, se atlaset over fargemetoder for mikroskopi.

Hva rødt mot blått ikke kan bevise

Røde staver betyr at organismene beholdt karbolfuksin gjennom behandlingen med syrealkohol. Dette funnet er forenlig med Mycobacterium tuberculosis, men CDCs veiledning om tuberkulosediagnostikk påpeker uttrykkelig at andre mykobakterier også er syrefaste. Artsidentifikasjon krever derfor dyrking og nukleinsyretesting, ikke farge.

Tekniske feil oppstår særlig rundt de to vasketrinnene. Utilstrekkelig avfarging lar bakgrunnsmateriale forbli rødt og kan føre til falskt positive avlesninger. For kraftig avfarging fjerner primærfarge som er svakt bundet, og bidrar til falskt negative resultater. For kraftig kontrastfarging skjuler fåtallige basiller i blått. Tykke utstryk, utfelte reagenser og forurenset skyllevann tilfører egne artefakter.

Sensitiviteten begrenses av antallet organismer, uansett hvor godt teknikken utføres. Konvensjonell utstryksmikroskopi krever omtrent 5,000 til 10,000 basiller per milliliter sputum, og eldre kunnskapsoppsummeringer fra CDC anslo sensitiviteten til omtrent 45 til 80 prosent blant dyrkingsbekreftede lungetuberkulosetilfeller. Et negativt utstryk utelukker derfor aldri tuberkulose. Gjeldende CDC-veiledning opprettholder dyrking i tillegg til hvert utstryk og anbefaler nukleinsyreamplifikasjonstesting av minst én luftveisprøve når lungetuberkulose vurderes og resultatet vil endre håndteringen.

Praktisk arbeid skal følge godkjente protokoller

Undervisningsbeskrivelser, inkludert denne artikkelen, gir ikke godkjenning til å utføre klinisk arbeid. Ved praktisk laboratoriearbeid skal laboratoriets validerte standardprosedyre følges, i samsvar med gjeldende dokumenter fra CDC, APHL eller CLSI. CDCs referanse for syrefast farging i Stacks-arkivet viser hvordan slike prosedyrer spesifiserer reagenser og resultatavlesning. Arbeid med tuberkuloseprøver krever inneslutning: Utstryk fremstilles i et biologisk sikkerhetskabinett fordi fremstillingen genererer aerosoler og sprut. CDCs veiledning om laboratoriesikkerhet fastslår at selv varmefikserte utstryk kan inneholde levedyktige tuberkelbasiller og fortsatt må håndteres som kontaminerte. Oppføringen i CDC Public Health Image Library for et utstryk farget med karbolfuksin og metylenblått og undersøkt for M. leprae er en nyttig påminnelse om at metoden har et bruksområde utover tuberkulose: Den samme kontrasten mellom rødt og blått brukes overalt der man leter etter syrefaste organismer, og en grundig negativ avlesning er i seg selv et resultat som bør registreres.

Avlesning av det ferdige objektglasset

Kontrastfargen viser sin verdi under den innledende gjennomgangen. En mikroskopør som skanner ved lav forstørrelse, bruker først den blå bakgrunnen til å vurdere utstrykets kvalitet: jevn cellefordeling, intakte vertsceller som hjelp til fokusering og ingen kraftige utfellinger. Røde kandidater fanger deretter blikket nettopp fordi ingenting annet på objektglasset er rødt. Bekreftelse skjer med oljeimmersjon, der ekte basiller viser de forventede tynne, noen ganger lett buede eller perlelignende stavene, snarere enn ensartede fargestoffrester.

Bakgrunnsfargingen bestemmer også ordlyden i rapporten. Et objektglass med røde basiller rapporteres som syrefaste basiller påvist, ofte med en semikvantitativ gradering etter laboratoriets skala. Et objektglass uten røde organismer rapporteres som ingen syrefaste basiller påvist, aldri som negativt for tuberkulose. Skillet er viktig fordi det blå feltet viser at fargingen fungerte, at cellene tok opp kontrastfarge og at optikken var tilstrekkelig, men ikke sier noe om organismer under påvisningsgrensen. Et blått felt uten funn er et gyldig resultat om objektglasset, ikke en konklusjon om pasienten.

Husk arbeidsdelingen, så blir rapporteringen enkel. Karbolfuksin påviser kandidater. Syrealkohol utfører testen. Metylenblått gjør bare svaret lesbart: Rødt beholdt fargestoffet ved syrebehandling, blått mistet det. Alt annet – art, mengde og klinisk betydning – kommer fra arbeid utover objektglasset.